Snelle videomicroscopie-analyse is een relatief eenvoudig uit te voeren, snel, kosteneffectief en, in ervaren handen, een aanzienlijk betrouwbaar hulpmiddel voor eerstelijnsdiagnostiek van primaire ciliaire dyskinesie, dat beschikbaar zou moeten zijn in elk centrum dat betrokken is bij diagnostiek en de behandeling van ernstige longziekten.
Primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is een aangeboren aandoening die voornamelijk wordt overgeërfd in een autosomaal recessieve eigenschap. De aandoening veroorzaakt verstoring in de beweging van trilharen, wat leidt tot ernstige verslechtering van de mucociliaire klaring (MCC). Als niet gediagnosticeerd of te laat gediagnosticeerd, leidt de aandoening tot de ontwikkeling van bronchiëctasieën en ernstige schade aan de longen op latere leeftijd. De meeste methoden voor het diagnosticeren van PCD zijn tijdrovend en vereisen uitgebreide economische middelen om ze vast te stellen. High-speed videomicroscopie-analyse (HSVMA) is het enige diagnostische hulpmiddel om levende ademhalingscellen met kloppende trilharen in vitro te visualiseren en te analyseren. Het is snel, kosteneffectief en, in ervaren handen, zeer betrouwbaar als diagnostisch hulpmiddel voor PCD. Bovendien zijn klassieke diagnostische maatregelen zoals transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) niet van toepassing op sommige mutaties, omdat morfologische veranderingen afwezig zijn.
Dit artikel beschrijft het proces van het verzamelen van respiratoire epitheelcellen, de verdere voorbereiding van het monster en het proces van HSVMA. We beschrijven ook hoe geborstelde cellen met succes ongedeerd en kloppend kunnen worden gehouden door ze in een voedend medium te houden voor opslag en transport naar de onderzoekslocatie in gevallen waarin een kliniek niet over de apparatuur beschikt om HSVMA uit te voeren. Ook worden video’s getoond met pathologische slagpatronen van patiënten met een mutatie in het dyneïnearm zware keten 11-gen (DNAH11), dat niet kan worden gediagnosticeerd met TEM; het resultaat van een niet-overtuigende HSVMA als gevolg van infectie van de bovenste luchtwegen, evenals een mislukt poetsen met superpositie van rode bloedcellen. Met dit artikel willen we elke eenheid die zich bezighoudt met pulmonologiepatiënten en zeldzame longziekten aanmoedigen om HSVMA uit te voeren als onderdeel van hun dagelijkse routinediagnostiek voor PCD of de monsters naar een centrum te sturen dat gespecialiseerd is in het uitvoeren van HSVMA.
Primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is een zeldzame, erfelijke genetische aandoening, die verstoringen veroorzaakt in de beweging van kloppende trilharen. Als het niet wordt gediagnosticeerd, leidt dit tot ernstige longschade op latere leeftijd als gevolg van ernstige stoornissen van MCC. In het verleden werd de prevalentie geschat op 1:4.000 tot 50.000. Vanwege de gestaag verbeterende diagnostiek en een groeiend bewustzijn van de aandoening, suggereren updates over de prevalentie van PCD dat het veel vaker voorkomt en waarschijnlijk in het bereik van 1: 4.000 tot 20.000 in plaats van 1,2. Patiënten met PCD worden echter nog steeds ondergediagnosticeerd of te laat gediagnosticeerd 1,3. Daarom moeten zuigelingen met congenitale situs inversus en/of heterotaxie of perinatale rhinorrhea, neonatale ademnood, een verstopte neus en voedingsproblemen verdacht worden voor PCD. Op latere leeftijd zijn chronische otitis, terugkerende longontsteking, rhinosinusitis en een chronische, typische natte hoest als gevolg van verminderde MCC de kenmerkende symptomen van PCD, die in combinatie met bronchiëctasieën en verminderde longfunctie doorgaan tot in de volwassenheid2.
Patiënten waarvan wordt vermoed dat ze PCD hebben, kunnen worden gediagnosticeerd met behulp van verschillende diagnostische hulpmiddelen. TEM is in het verleden beschouwd als de gouden standaard voor eerstelijns diagnostiek. Tot 30% van de PCD-gevallen vertoont echter geen abnormale ultrastructuur 1,3,4,5,6, wat een andere diagnostische aanpak vereist. Daarom suggereren een groeiend aantal centra en de richtlijnen van de European Respiratory Society (ERS) een combinatie van nasaal stikstofmonoxide (nNO) en HSVMA als eerstelijnsdiagnostiek 1,7,9,10. HSVMA en nNO zijn ook de meest kosteneffectieve opties bij het identificeren van een patiënt met PCD11. Maar zelfs als genetische tests in de diagnostiek zouden worden opgenomen, moet er rekening mee worden gehouden dat er momenteel geen op zichzelf staande test of combinatie van tests is die PCD met 100% zekerheid kan uitsluiten 8,9,10.
Van de beschikbare diagnostische opties is HSVMA de enige test die zich richt op levende, met trilharen bedekte ademhalingscellen en het ciliaire slagpatroon (CBP) en de ciliaire slagfrequentie (CBF) evalueert. In tegenstelling tot TEM zijn de resultaten van HSVMA snel beschikbaar, meestal op de dag van testen, terwijl de resultaten van TEM maanden nadat het monster is genomen, kunnen aankomen. HSVMA kan voor alle leeftijdsgroepen worden toegepast, terwijl nNO een hoge mate van naleving vereist; pogingen om het te gebruiken onder de leeftijd van 5 jaar zijn meestal niet succesvol10. In ervaren handen heeft HSVMA een uitstekende gevoeligheid en specificiteit om PCD te diagnosticeren bij respectievelijk 100% en 96%,12.
Dit artikel beschrijft de stapsgewijze procedure om HSVMA uit te voeren, inclusief het oogsten van met trilharen bedekte ademhalingscellen uit het inferieure turbinaat van de neus, het behoud van geoogste cellen in een celvoederend medium voor transport naar de plaats van onderzoek en het proces van microscopische video-analyse om CBF en CBP te bepalen. Daarnaast worden enkele videoclips van patiënten getoond, waarin normale CCP’s en CBF’s worden vergeleken met abnormale trilharenfunctie (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 en Video 8).
Hier wordt het diagnostische proces voor PCD met behulp van HSVMA beschreven en besproken in het licht van de eerstelijns diagnostiek. Ondanks dat het relatief eenvoudig vast te stellen is,kosteneffectief 11 en een betrouwbare methode in ervaren handen12, is HSVMA geen diagnostische maatregel zonder valkuilen. Abnormale CBF en CBP kunnen te wijten zijn aan secundaire infectie, wat leidt tot ontsteking van de broncho-respiratoire epithelia15, en om de…
The authors have nothing to disclose.
We willen in het bijzonder de kinderverpleegkundige mevrouw Johanna Juvankoski bedanken voor haar uitstekende hulp bij het poetsen. We willen ook professor Heymut Omran (Universiteitskliniek Münster, UKM) speciaal bedanken voor het verlenen van toestemming om de schematische figuur van normale ciliaire beweging van hun website te gebruiken. Tot slot willen we de heer Alan Brown BA (Hons), PGCE, bedanken voor het proeflezen van het manuscript.
Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
Cold pack | any | for preservation and transport | |
Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
Small polystyrene box with lid | any | for transport |