Summary

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למבשרי תאי בטא בלבלב במערכת תרבית דו-ממדית

Published: December 16, 2021
doi:

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משופרת להגברת הביטוי המשותף של פקטורי שעתוק PDX1 ו-NKX6.1 באבות לבלב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בחד-שכבתיים מישוריים. זה מושג על ידי חידוש המטריצה הטרייה, מניפולציה של צפיפות התא, וניתוק התאים האנדודרמליים.

Abstract

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) הם כלי מצוין לחקר התפתחות מוקדמת של הלבלב ולחקר התורמים הגנטיים לסוכרת. תאים מפרישי אינסולין שמקורם ב-hPSC יכולים להיווצר לצורך טיפול בתאים ומידול מחלות, עם יעילות מוגבלת ותכונות תפקודיות. אבות לבלב שמקורם ב-hPSC שהם מבשרי תאי בטא ותאים אנדוקריניים אחרים, כאשר מבטאים במשותף את שני גורמי השעתוק PDX1 ו-NKX6.1, מציינים את אבות האב לתאי בטא מתפקדים המפרישים אינסולין הן במבחנה והן ב-in vivo. אבות לבלב שמקורם ב-hPSC משמשים כיום לטיפול בתאים בחולי סוכרת מסוג 1 כחלק מניסויים קליניים. עם זאת, ההליכים הנוכחיים אינם מייצרים שיעור גבוה של NKX6.1 ואבות לבלב, מה שמוביל לייצור משותף של תאים אנדוקריניים לא מתפקדים ומעט תאים מגיבים לגלוקוז ומפרישי אינסולין. עבודה זו פיתחה אפוא פרוטוקול משופר ליצירת אבות לבלב שמקורם ב-hPSC, אשר ממקסמים את הביטוי המשותף של PDX1 ו-NKX6.1 במונו-שכבה דו-ממדית. הגורמים כגון צפיפות תאים, זמינות של מטריצה טרייה ודיסוציאציה של תאים אנדודרמליים שמקורם ב-hPSC מווסתים שהגדילו את רמות PDX1 ו-NKX6.1 באבות הלבלב שנוצרו וצמצמו את המחויבות לשושלת הכבד החלופית. המחקר מדגיש כי מניפולציה של הסביבה הפיזית של התא במהלך התמיינות במבחנה יכולה להשפיע על מפרט השושלת ועל ביטוי הגנים. לכן, הפרוטוקול הממוטב הנוכחי מאפשר את הדור הניתן להרחבה של PDX1 ו- NKX6.1 המבטאים צאצאים משותפים לטיפול בתאים ומידול מחלות.

Introduction

סוכרת היא הפרעה מטבולית מורכבת המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם. תוספת של אינסולין נחשבת לאפשרות הטיפול היחידה בסוכרת. מקרים מתקדמים יותר מטופלים באמצעות טיפול בהחלפת תאי בטא, המושג באמצעות השתלת לבלב שלם או איים 1,2. מספר סוגיות מקיפות את הטיפול בהשתלה, כגון הגבלה בזמינות ובאיכות הרקמה, פולשנות של הליכי השתלה בנוסף לצורך המתמשך בתרופות מדכאות חיסון. זה מחייב את הצורך בגילוי אפשרויות חדשניות ואלטרנטיביות לטיפול בתחליפי תאי בטא 2,3. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) התגלו לאחרונה ככלי מבטיח להבנת הביולוגיה של הלבלב האנושי וכמקור לא ממצה ואולי מותאם אישית יותר לטיפול בהשתלות 4,5,6,7. hPSCs, כולל תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs), הם בעלי יכולת התחדשות עצמית גבוהה ומעוררים כל סוג רקמה של גוף האדם. hESCs מופקים ממסת התא הפנימית של העובר, ו- hiPSCs מתוכנתים מחדש מכל תא סומטי 4,8.

פרוטוקולי התמיינות מכוונים ממוטבים ליצירת תאי בטא בלבלב מ-hPSCs המכוונים ברצף hPSCs דרך שלבי התפתחות הלבלב. פרוטוקולים אלה מייצרים אורגנואידים של איון שמקורם ב-hPSC. בעוד שהם השתפרו מאוד בהגדלת חלקם של תאי בטא בלבלב בהם, היעילות של פרוטוקולים משתנה מאוד. זה לא עולה ליותר מ ~ 40% של NKX6.1+/אינסולין+ או C-פפטיד + תאים 5,9,10,11,12,13. עם זאת, תאי הבטא שנוצרו אינם זהים לחלוטין לתאי הבטא האנושיים הבוגרים מבחינת פרופילי השעתוק וחילוף החומרים שלהם ותגובתם לגלוקוז 4,5,14. תאי הבטא שמקורם ב-hPSC חסרים ביטוי גנטי של סמני תאי בטא מרכזיים כגון PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 ו-KCNK3 בהשוואה לאיים5 של בני אדם בוגרים. בנוסף, תאי הבטא שמקורם ב-hPSC הפחיתו את איתות הסידן בתגובה לגלוקוז. הם מזוהמים בתאים הפוליהורמונליים שנוצרו במשותף שאינם מפרישים כמויות מתאימות של אינסולין בתגובה להעלאת רמות הגלוקוז5. מצד שני, אבות לבלב שמקורם ב-hPSC, שהם מבשרי איונים, יכולים להיווצר בצורה יעילה יותר במבחנה בהשוואה לתאי בטא, וכאשר הם מושתלים ב-vivo, הם יכולים להבשיל לתאי בטא מתפקדים המפרישים אינסולין15,16. ניסויים קליניים מתמקדים כיום בהוכחת בטיחותם ויעילותם בעת השתלה בנבדקי T1D.

יש לציין כי ביטוי של גורמי השעתוק PDX1 (הומיאובוקס של הלבלב ותריסריון 1) ו- NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) בתוך אותו תא אב בלבלב הוא חיוני למחויבות כלפי שושלת תאי בטא5. אבות לבלב שאינם מצליחים לבטא את NKX6.1 מולידים תאים אנדוקריניים פוליהורמונליים או תאי בטא לא מתפקדים17,18. לכן, ביטוי משותף גבוה של PDX1 ו- NKX6.1 בשלב האב של הלבלב חיוני ליצירת מספר רב של תאי בטא פונקציונליים. מחקרים הראו כי גוף עוברי או תרבית תלת-ממדית משפרים את PDX1 ו-NKX6.1 אצל אבות לבלב שבהם התאים המתמיינים מצטברים, ונעים בין 40%-80% מאוכלוסיית PDX1+/NKX6.1+12,19. עם זאת, בהשוואה לתרביות השעיה, תרביות התמיינות דו-ממדיות הן חסכוניות יותר, ישימות ונוחות יותר ליישום בקווי תאיםמרובים 5. לאחרונה הראינו שתרביות בידול חד-שכבתי מניבות יותר מ-90% מ-PDX1+/NKX6.1+ המבטא במשותף20,21,22 אבות לבלב שמקורם ב-hPSC. השיטה המדווחת העניקה יכולת שכפול גבוהה לאבות הלבלב שנוצרו ומנעה מפרטי גורל חלופיים כגון שושלת הכבד21. לכן, כאן, פרוטוקול זה מדגים שיטה יעילה ביותר להתמיינות של hPSCs למבשרי תאי בטא בלבלב המבטאים במשותף PDX1 ו- NKX6.1. שיטה זו משתמשת בטכניקה של ניתוק אנדודרם שמקורו ב-hPSC ומניפולציה של צפיפות התא, ולאחר מכן איתות FGF ורטינואידי מורחב, כמו גם עיכוב קיפוד כדי לקדם ביטוי משותף של PDX1 ו-NKX6.1 (איור 1). שיטה זו יכולה להקל על דור מדרגי של מבשרי תאי בטא בלבלב שמקורם ב-hPSC לטיפול בהשתלות ומידול מחלות.

Protocol

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר המוסדי המתאים ובוצע על פי הסטנדרטים האתיים שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר או סטנדרטים אתיים דומים. הפרוטוקול אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של HMC (מס’ 16260/16) ומכון המחקר הביו-רפואי של קטאר (QBRI) (מס’ 2016-003). עבודה זו ממוטבת עבור hE…

Representative Results

התוצאות מראות כי פרוטוקול P2-D ממוטב (איורים 1A) שיפר את יעילות ההתמיינות של אבות הלבלב על-ידי ויסות הביטוי המשותף PDX1 ו-NKX6.1 (איור 2A,B ואיור 3A). בפרט, התוצאות הראו כי דיסוציאציה של תאים אנדודרמליים וציפוי מחדש שלהם על מטריצת ממברנה טרייה ?…

Discussion

עבודה זו מתארת פרוטוקול משופר ליצירת אבות לבלב מ- hPSCs עם ביטוי משותף גבוה של PDX1 ו- NKX6.1. דיסוציאציה וציפוי מחדש של האנדודרם שמקורו ב-hPSC בחצי צפיפות על מטריצה טרייה הביאו ל-PDX1 ו-NKX6.1 גבוהים יותר באבות לבלב שמקורם ב-hPSC.

למרות שקוקטייל גורם הגדילה עבור כל שלב דומה מאוד ל- P1-ND<sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מענק מקרן המחקר הלאומית של קטאר (QNRF) (מענק מס’. NPRP10-1221-160041).

Materials

15 mL, conical, centrifuge tubes Thermo Scientific 339651
20X TBS Tween 20 Thermo Scientific 28360
24-well culture plates, flat bottom with lid Costar 3524
50 mL, conical, centrifuge tubes Thermo Scientific 339652
6- well culture plates, multidish Thermo Scientific 140685
Accutase Stem Cell Technologies 0-7920
Activin A R&D 338-AC Reconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal DSHB F55A12-C Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal Abcam ab47308 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit A ThermoFisher 12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free Sigma A7030
CHIR 99021 Tocris 4423 Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucose ThermoFisher 41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Invitrogen A10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 A-21206
DPBS 1X ThermoFisher 14190144
EGF ThermoFisher PHG0313 Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10 R&D 345-FG Reconstituted in PBS
Glucose Sigma Aldrich G8644
Hoechst 33258 Sigma 23491-45-4
Inverted microscope Olympus IX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X) Gibco 12660-012
KnockOut SR serum replacement Gibco 10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C) Sigma A92902 Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230 Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131 ThermoFisher 10372019
Mouse anti-SOX17 ORIGENE CF500096 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 85850 Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PES ThermoFisher 566-0020
Nicotinamide Sigma 72340 Reconstituted in distilled water
NOGGIN R&D 6057-NG Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz sc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2 Cell signaling technology 3143 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625 Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632) ReproCell 04-0012-02 Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE Stellar Scientific FSC-9010
SANT-1 Sigma Aldrich S4572 Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonate Sigma S5761-500G
StemFlex ThermoFisher A3349401 Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis Slide Invitrogen T10794
Tali image-based cytometer automated cell counter Invitrogen T10796
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
TrypLE 100 mL ThermoFisher 12563011
Tween 20 Sigma P2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575-038

References

  1. Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
  2. Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
  3. Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
  4. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  5. Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
  6. Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
  7. Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
  8. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  9. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  10. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  11. Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
  12. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  13. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  14. Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
  15. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  16. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  17. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  18. Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
  19. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  20. Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  21. Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
  22. Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
  23. Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
  24. Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
  25. Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
  26. Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
  27. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  28. Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
  29. Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
  30. Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
  31. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  32. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  33. Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
  34. Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
  35. Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
  36. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
  37. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
  38. Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
  39. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).

Play Video

Cite This Article
Memon, B., Abdelalim, E. M. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System. J. Vis. Exp. (178), e63298, doi:10.3791/63298 (2021).

View Video