2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化
Summary
本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。
Abstract
ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、初期の膵臓発生を研究し、糖尿病の遺伝的寄与因子を調査するための優れたツールです。しかし、hPSC由来のインスリン分泌細胞は、細胞治療や疾患モデリングのために生成することができますが、効率と機能特性は限られています。ベータ細胞および他の内分泌細胞の前駆体であるhPSC由来の膵臓前駆細胞は、2つの転写因子PDX1およびNKX6.1を共発現すると、in vitro および in vivoの両方で機能的なインスリン分泌ベータ細胞への前駆細胞を指定する。hPSC由来の膵臓前駆細胞は現在、臨床試験の一環として1型糖尿病患者の細胞療法に使用されています。しかし、現在の手順では、NKX6.1および膵臓前駆細胞の割合が高くないため、機能しない内分泌細胞の共生成と、グルコース応答性のインスリン分泌細胞がほとんど発生しません。したがって、この研究は、2D単層でPDX1とNKX6.1の共発現を最大化するhPSC由来の膵臓前駆細胞を生成するための強化されたプロトコルを開発しました。細胞密度、新鮮なマトリックスの利用可能性、hPSC由来の内胚葉細胞の解離などの要因が調節され、生成された膵臓前駆細胞のPDX1およびNKX6.1レベルが上昇し、代替肝系統への関与が最小限に抑えられます。今回の研究は、 in vitro 分化中に細胞の物理的環境を操作すると、系統の仕様と遺伝子発現に影響を与える可能性があることを強調している。したがって、現在最適化されたプロトコルは、細胞治療および疾患モデリングのためのPDX1およびNKX6.1共発現前駆細胞のスケーラブルな生成を容易にする。
Introduction
糖尿病は、世界中の何百万人もの人々に影響を与える複雑な代謝障害です。インスリンの補給は、糖尿病の唯一の治療選択肢と考えられています。より進行した症例は、死体膵臓全体または膵島のいずれかの移植によって達成されるベータ細胞補充療法で治療されます1,2。免疫抑制剤の継続的な必要性に加えて、組織の入手可能性と質の制限、移植手順の侵襲性など、移植療法を取り巻くいくつかの問題。これには、ベータ細胞補充療法のための新規かつ代替的な選択肢を発見する必要性が必要です2,3。ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、最近、ヒト膵臓の生物学を理解するための有望なツールとして、また移植治療のための非網羅的で潜在的によりパーソナライズされた供給源として浮上しています4,5,6,7。ヒト胚性幹細胞(hESC)やヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)などのhPSCは、自己複製能力が高く、あらゆる組織型の人体を生じさせます。hESCは胚の内部細胞塊に由来し、hiPS細胞は任意の体細胞から再プログラムされます4,8。
指向性分化プロトコルは、hPSCから膵臓ベータ細胞を生成するように最適化されており、hPSCを膵臓発生段階までinvitroで順次指示します。これらのプロトコルは、hPSC由来の膵島オルガノイドを生成します。それらはその中の膵臓ベータ細胞の割合を増加させることで大幅に改善されましたが、プロトコルの効率は非常に変動します。NKX6.1+/インスリン+またはC-ペプチド+細胞の~40%以上に増加しない5、9、10、11、12、13。しかしながら、生成されたベータ細胞は、それらの転写および代謝プロファイルならびにグルコースに対するそれらの応答の点で、成体ヒトベータ細胞と完全に同一ではない4,5,14。hPSC由来のベータ細胞は、成体ヒト膵島と比較して、PCSK2、PAX6、UCN3、MAFA、G6PC2、およびKCNK3などの主要なベータ細胞マーカーの遺伝子発現を欠いています5。さらに、hPSC由来のベータ細胞は、グルコースに応答してカルシウムシグナル伝達を低下させています。それらは、グルコースレベルの上昇に応答して適切な量のインスリンを分泌しない共生成多ホルモン細胞で汚染されています5。一方、膵島の前駆体であるhPSC由来の膵臓前駆細胞は、ベータ細胞と比較してin vitroでより効率的に生成でき、in vivoに移植すると、機能的なインスリン分泌ベータ細胞に成熟する可能性があります15,16。臨床試験は現在、T1D被験者における移植時の安全性と有効性を実証することに焦点を当てています。
特に、同じ膵臓前駆細胞内での転写因子PDX1(膵臓および十二指腸ホメオボックス1)およびNKX6.1(NKX6ホメオボックス1)の発現は、ベータ細胞系譜5へのコミットメントにとって非常に重要です。NKX6.1を発現しない膵臓前駆細胞は、多ホルモン性内分泌細胞または非機能性ベータ細胞を生じさせる17,18。したがって、膵臓前駆細胞期におけるPDX1とNKX6.1の高い共発現は、最終的に多数の機能的ベータ細胞を生成するために不可欠である。研究によると、胚様体または3D培養は、分化細胞が凝集している膵臓前駆細胞のPDX1およびNKX6.1を増強し、PDX1 + / NKX6.1 +集団の40%〜80%の間で変動することが示されています12,19。しかし、浮遊培養と比較して、2D分化培養は、複数の細胞株への適用において、より費用効果が高く、実現可能で、便利です5。我々は最近、単層分化培養により、PDX1+/NKX6.1+を共発現するhPSC由来の膵臓前駆細胞を最大90%以上生成することを示しました20,21,22。報告された方法は、生成された膵臓前駆細胞に高い複製能力を与え、肝系統21などの代替運命仕様を防止しました。したがって、本明細書において、このプロトコルは、PDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓ベータ細胞前駆体へのhPSCの分化のための非常に効率的な方法を実証する。この方法は、hPSC由来の内胚葉を解離して細胞密度を操作する技術を利用し、その後、FGFとレチノイドのシグナル伝達を拡張し、ヘッジホッグを阻害してPDX1とNKX6.1の共発現を促進します(図1)。この方法は、移植治療および疾患モデリングのためのhPSC由来膵臓ベータ細胞前駆体のスケーラブルな生成を促進することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、PDX1とNKX6.1の高い共発現を持つhPSCから膵臓前駆細胞を生成するための強化されたプロトコルについて説明します。新鮮なマトリックス上での半密度でのhPSC由来内胚葉の解離および再メッキは、hPSC由来膵臓前駆細胞においてより高いPDX1およびNKX6.1をもたらした。
各ステージの成長因子カクテルはP1-ND27と非常に類似していますが、FGFとレ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カタール国立研究基金(QNRF)からの助成金によって資金提供されました(助成金番号。NPRP10-1221-160041)。
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
