Abgabe von exogenen künstlich synthetisierten miRNA-Nachahmungen an die Niere unter Verwendung von Polyethylenimin-Nanopartikeln in verschiedenen Mausmodellen für Nierenerkrankungen
Summary
In dieser Arbeit bringen wir exogene künstlich synthetisierte miRNA-Nachahmungen in die Niere durch Schwanzveneninjektion eines nicht-viralen Vektors und Polyethylenimin-Nanopartikel in verschiedenen Mausmodellen für Nierenerkrankungen. Dies führte zu einer signifikanten Überexpression der Ziel-miRNA in der Niere, was in mehreren Mausmodellen zu einer Hemmung des Fortschreitens der Nierenerkrankung führte.
Abstract
microRNAs (miRNAs), kleine nicht-kodierende RNAs (21-25 Basen), die nicht in Proteine übersetzt werden, hemmen viele Target Messenger-RNAs (mRNAs), indem sie ihre Translation bei verschiedenen Nierenerkrankungen destabilisieren und hemmen. Daher ist die Abwechslung der miRNA-Expression durch exogene, künstlich synthetisierte miRNA-Nachahmer eine potenziell nützliche Behandlungsoption, um die Entwicklung vieler Nierenerkrankungen zu hemmen. Da die Serum-RNAase jedoch systematisch verabreichte exogene miRNA-Nachahmer in vivo sofort abbaut, bleibt die Abgabe von miRNA an die Niere eine Herausforderung. Daher sind Vektoren notwendig, die exogene miRNA-Nachahmer vor dem Abbau durch RNAase schützen und sie signifikant an die Niere abgeben können. In vielen Studien wurden virale Vektoren verwendet, um exogene miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren an die Niere abzugeben. Virale Vektoren können jedoch eine Interferonantwort und/oder genetische Instabilität hervorrufen. Daher ist die Entwicklung viraler Vektoren auch eine Hürde für den klinischen Einsatz exogener miRNA-Mimics oder -Inhibitoren. Um diese Bedenken hinsichtlich viraler Vektoren auszuräumen, haben wir eine nicht-virale Vektormethode entwickelt, um miRNA-Nachahmungen durch Schwanzveneninjektion von Polyethylenimin-Nanopartikeln (PEI-NPs) in die Niere zu bringen, was zu einer signifikanten Überexpression von Ziel-miRNAs in mehreren Mausmodellen für Nierenerkrankungen führte.
Introduction
miRNAs, kleine nicht-kodierende RNAs (21-25 Basen), die nicht in Proteine übersetzt werden, hemmen viele Zielboten-RNAs (mRNAs), indem sie sie destabilisieren und ihre Translation bei verschiedenen Nierenerkrankungen hemmen 1,2. Daher ist die Gentherapie mit exogenen, künstlich synthetisierten miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren eine potenzielle neue Option, um die Entwicklung vieler Nierenerkrankungen zu hemmen 3,4,5.
Trotz des Versprechens von miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren für die Gentherapie bleibt die Verabreichung an Zielorgane eine große Hürde für In-vivo-Experimente, um ihr klinisches Potenzial zu entwickeln. Da künstlich synthetisierte miRNA-Nachahmer oder -Inhibitoren einem sofortigen Abbau durch die Serum-RNase unterliegen, verkürzt sich ihre Halbwertszeit bei systemischer Verabreichung in vivo6. Darüber hinaus ist die Effizienz von miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren, die Plasmamembran zu durchdringen und Zytoplasma zu transfizieren, ohne geeignete Vektoren im Allgemeinen viel geringer zu sein 7,8. Diese Evidenzlinien deuten darauf hin, dass die Entwicklung des miRNA-Nachahmungs- oder Inhibitor-Verabreichungssystems für die Niere erforderlich ist, um ihren Einsatz im klinischen Umfeld zu ermöglichen und sie zu einer neuen Behandlungsoption für Patienten mit verschiedenen Nierenerkrankungen zu machen.
Virale Vektoren wurden als Träger verwendet, um exogene miRNA-Nachahmungen oder -Inhibitoren an die Niere zu liefern 9,10. Obwohl sie im Hinblick auf biologische Sicherheit und Transfektionswirksamkeit entwickelt wurden, können virale Vektoren dennoch eine Interferonantwort und/oder genetische Instabilität verursachen11,12. Um diese Bedenken auszuräumen, haben wir ein miRNA-Nachahmungssystem für die Niere entwickelt, bei dem Polyethylenimin-Nanopartikel (PEI-NPs), ein nichtviraler Vektor, in mehreren Mausmodellen für Nierenerkrankungen verwendetwerden 13,14,15.
PEI-NPs sind lineare polymerbasierte NPs, die Oligonukleotide, einschließlich miRNA-Nachahmungen, effektiv an die Niere abgeben können und aufgrund ihrer langfristigen Sicherheit und Biokompatibilität als bevorzugt für die Herstellung nichtviraler Vektoren angesehen werden13,16,17.
Diese Studie demonstriert die Effekte einer systematischen exogenen miRNA-Nachahmung der Verabreichung mit PEI-NPs durch Schwanzveneninjektion in Nierenfibrose-Modellmäusen, die durch einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) erzeugt wurden. Darüber hinaus zeigen wir die Effekte der systematischen exogenen miRNA-Mimikabgabe mit PEI-NPs mittels Schwanzveneninjektion in Modellmäusen für diabetische Nierenerkrankungen (db/db-Mäuse: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) und Modellmäusen mit akutem Nierenversagen, die durch renale Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) hervorgerufen wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit Hilfe des in diesem Manuskript vorgestellten Protokolls können PEI-NPs miRNA-Nachahmungen an die Niere abgeben, um eine Überexpression von Ziel-miRNAs zu induzieren, was zu Behandlungseffekten in In-vivo-Mausmodellen verschiedener Nierenerkrankungen führt, darunter Nierenfibrose, diabetische Nierenerkrankung und AKI.
Die Methode zur Herstellung des Komplexes aus PEI-NPs und miRNA-Mimik ist sehr einfach. Die positiv geladene Oberfläche von PEI-NPs fängt die miRNA-Nachahmung ei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI unterstützt (Förderkennzeichen 21K08233). Wir danken Edanz (https://jp.edanz.com/ac) für die Bearbeitung der Entwürfe dieses Manuskripts.
Materials
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
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