कई किडनी रोग माउस मॉडल में पॉलीइथाइलेनिमाइन नैनोकणों का उपयोग करके एक्सोजेनस कृत्रिम रूप से संश्लेषित एमआरएनए मिमिक का वितरण
Summary
यहां, हम कई गुर्दे रोग माउस मॉडल में एक गैर-वायरल वेक्टर और पॉलीथाइलेनिमाइन नैनोकणों के पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से एक्सोजेनस कृत्रिम रूप से संश्लेषित माइआरएनए को किडनी की नकल करते हैं। इससे गुर्दे में लक्ष्य माइआरएनए की महत्वपूर्ण अतिवृद्धि हुई, जिसके परिणामस्वरूप कई माउस मॉडल में गुर्दे की बीमारी की प्रगति रुक गई।
Abstract
माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए), छोटे नॉनकोडिंग आरएनए (21-25 बेस) जो प्रोटीन में अनुवादित नहीं होते हैं, विभिन्न गुर्दे की बीमारियों में उनके अनुवाद को अस्थिर और बाधित करके बहुत सारे लक्ष्य मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) को रोकते हैं। इसलिए, बहिर्जात कृत्रिम रूप से संश्लेषित माइआरएनए मिमिक द्वारा एमआईआरएनए अभिव्यक्ति का परिवर्तन कई गुर्दे की बीमारियों के विकास को रोकने के लिए एक संभावित उपयोगी उपचार विकल्प है। हालांकि, क्योंकि सीरम आरएनएस तुरंत विवो में व्यवस्थित रूप से प्रशासित बहिर्जात मिआरएनए मिमिक को कम कर देता है, गुर्दे में एमआईआरएनए का वितरण एक चुनौती बनी हुई है। इसलिए, वैक्टर जो बहिर्जात मिआरएनए की रक्षा कर सकते हैं, आरएनएस द्वारा गिरावट से नकल करते हैं और उन्हें गुर्दे तक पहुंचाते हैं, आवश्यक हैं। कई अध्ययनों ने वायरल वैक्टर का उपयोग एक्सोजेनस माइआरएनए मिमिक या इनहिबिटर को किडनी तक पहुंचाने के लिए किया है। हालांकि, वायरल वैक्टर एक इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया और / या आनुवंशिक अस्थिरता का कारण बन सकते हैं। इसलिए, वायरल वैक्टर का विकास बहिर्जात मिआरएनए मिमिक या इनहिबिटर के नैदानिक उपयोग के लिए भी एक बाधा है। वायरल वैक्टर के बारे में इन चिंताओं को दूर करने के लिए, हमने पॉलीइथाइलेनिमाइन नैनोकणों (पीईआई-एनपी) के पूंछ नस इंजेक्शन का उपयोग करके गुर्दे में एमआरएनए मिमिक्स देने के लिए एक नॉनवायरल वेक्टर विधि विकसित की, जिसके कारण गुर्दे की बीमारी के कई माउस मॉडल में लक्ष्य एमआईआरएनए का महत्वपूर्ण अतिवृद्धि हुआ।
Introduction
एमआईआरएनए, छोटे नॉनकोडिंग आरएनए (21-25 बेस) जो प्रोटीन में अनुवादित नहीं होते हैं, उन्हें अस्थिर करके और विभिन्न गुर्देकी बीमारियों में उनके अनुवाद को रोककर बहुत सारे लक्ष्य संदेशवाहक आरएनए (एमआरएनए) को रोकते हैं। इसलिए, बहिर्जात कृत्रिम रूप से संश्लेषित माइआरएनए मिमिक या इनहिबिटर को नियोजित करने वाली जीन थेरेपी कई गुर्दे की बीमारियोंके विकास को रोकने के लिए एक संभावित नया विकल्प है 3,4,5.
जीन थेरेपी के लिए एमआरएनए मिमिक या इनहिबिटर के वादे के बावजूद, लक्षित अंगों को डिलीवरी विवो प्रयोगों में उनकी नैदानिक क्षमता विकसित करने के लिए एक बड़ी बाधा बनी हुई है। चूंकि कृत्रिम रूप से संश्लेषित मिआरएनए मिमिक या इनहिबिटर सीरम आरएनएस द्वारा तत्काल गिरावट के अधीन हैं, इसलिए विवो6 में प्रणालीगत प्रशासन पर उनका आधा जीवन छोटा हो जाता है। इसके अतिरिक्त, प्लाज्मा झिल्ली को पार करने के लिए एमआरएनए मिमिक्स या इनहिबिटर की दक्षता और साइटोप्लाज्म को स्थानांतरित करना आम तौर पर उचित वैक्टर 7,8 के बिना बहुत कम होता है। साक्ष्य की इन पंक्तियों से पता चलता है कि गुर्दे के लिए एमआईआरएनए मिमिक्स या इनहिबिटर डिलीवरी सिस्टम के विकास की आवश्यकता होती है, ताकि नैदानिक सेटिंग्स में उनके उपयोग को सक्षम किया जा सके और उन्हें विभिन्न गुर्दे की बीमारियों वाले रोगियों के लिए एक नया उपचार विकल्प बनाया जा सके।
वायरल वैक्टर का उपयोग एक्सोजेनस माइआरएनए मिमिक या इनहिबिटर को किडनी 9,10 तक पहुंचाने के लिए वाहक के रूप में किया गया है। यद्यपि उन्हें जैव सुरक्षा और अभिकर्मक प्रभावकारिता के लिए विकसित किया गया है, वायरल वैक्टर अभी भी एक इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया और / या आनुवंशिक अस्थिरता11,12 का कारण बन सकते हैं। इन चिंताओं को दूर करने के लिए, हमने गुर्दे की बीमारी13,14,15 के कई माउस मॉडल में पॉलीइथाइलेनिमाइन नैनोकणों (पीईआई-एनपी), एक गैर-वायरल वेक्टर का उपयोग करके गुर्दे के लिए एक एमआईआरएनए मिमिक डिलीवरी सिस्टम विकसित किया।
पीईआई-एनपी रैखिक बहुलक-आधारित एनपी हैं जो प्रभावी रूप से गुर्दे में मिआरएनए मिमिक सहित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स वितरित कर सकते हैं, और उनकी दीर्घकालिक सुरक्षा और जैव-रासायनिकता 13,16,17 के कारण गैर-वायरल वैक्टर तैयार करने के लिए बेहतर माना जाता है।
यह अध्ययन एकतरफा मूत्रवाहिनी रुकावट (यूयूओ) द्वारा उत्पादित गुर्दे फाइब्रोसिस मॉडल चूहों में पूंछ की नस इंजेक्शन के माध्यम से पीईआई-एनपी के साथ वितरण की नकल करता है। इसके अतिरिक्त, हम डायबिटिक किडनी रोग मॉडल चूहों (डीबी / डीबी चूहों: सी 57बीएलकेएस / जे आईएआर – + लेपर डीबी / + लेपर डीबी) और तीव्र गुर्दे की चोट मॉडल चूहों में पूंछकी नस इंजेक्शन के माध्यम से पीईआई-एनपी के साथ व्यवस्थित बहिर्जात मिआरएनए मिमिक डिलीवरी के प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके, पीईआई-एनपी लक्ष्य एमआईआरएनए के ओवरएक्प्रेशन को प्रेरित करने के लिए किडनी में एमआईआरएनए मिमिक्स वितरित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप गुर्दे फाइब्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आंशिक रूप से JSPS KAKENHI (अनुदान संख्या 21K08233) द्वारा समर्थित था। हम इस पांडुलिपि के मसौदों को संपादित करने के लिए एडांज (https://jp.edanz.com/ac) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
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