Leverans av exogent artificiellt syntetiserat miRNA-efterlikning till njurarna med användning av polyetyleniminnanopartiklar i flera musmodeller för njursjukdom
Summary
Här levererar vi exogent artificiellt syntetiserade miRNA-efterlikningar till njurarna via svansveninjektion av en icke-viral vektor och polyetyleniminnanopartiklar i flera musmodeller för njursjukdom. Detta ledde till signifikant överuttryck av mål-miRNA i njurarna, vilket resulterade i hämmad progression av njursjukdom i flera musmodeller.
Abstract
mikroRNA (miRNA), små icke-kodande RNA (21-25 baser) som inte översätts till proteiner, hämmar massor av målbudbärar-RNA (mRNA) genom att destabilisera och hämma deras översättning vid olika njursjukdomar. Därför är växling av miRNA-uttryck genom exogent artificiellt syntetiserat miRNA-härmningar ett potentiellt användbart behandlingsalternativ för att hämma utvecklingen av många njursjukdomar. Men eftersom serum-RNAas omedelbart bryts ned systematiskt administrerade exogena miRNA-härmar in vivo, är leverans av miRNA till njurarna fortfarande en utmaning. Därför är vektorer som kan skydda exogena miRNA-efterlikningar från nedbrytning av RNAas och signifikant leverera dem till njurarna nödvändiga. Många studier har använt virala vektorer för att leverera exogena miRNA-härmningar eller hämmare till njurarna. Virala vektorer kan dock orsaka interferonrespons och/eller genetisk instabilitet. Därför är utvecklingen av virala vektorer också ett hinder för klinisk användning av exogena miRNA-härmningar eller hämmare. För att övervinna dessa problem med virala vektorer utvecklade vi en icke-viral vektormetod för att leverera miRNA-efterlikningar till njurarna med hjälp av svansveninjektion av polyetyleniminnanopartiklar (PEI-NP), vilket ledde till signifikant överuttryck av målmiRNA i flera musmodeller av njursjukdom.
Introduction
miRNA, små icke-kodande RNA (21-25 baser) som inte översätts till proteiner, hämmar massor av målbudbärar-RNA (mRNA) genom att destabilisera dem och hämma deras översättning vid olika njursjukdomar 1,2. Därför är genterapi som använder exogena artificiellt syntetiserade miRNA-härmningar eller hämmare ett potentiellt nytt alternativ för att hämma utvecklingen av många njursjukdomar 3,4,5.
Trots löftet om miRNA-efterlikningar eller hämmare för genterapi är leverans till målorgan fortfarande ett stort hinder för in vivo-experiment att utveckla sin kliniska potential. Eftersom artificiellt syntetiserade miRNA-härmningar eller hämmare utsätts för omedelbar nedbrytning av serum-RNas, förkortas deras halveringstid vid systemisk administrering in vivo6. Dessutom är effektiviteten hos miRNA-härmningar eller hämmare att passera plasmamembranet och transfekt cytoplasma i allmänhet mycket lägre utan lämpliga vektorer 7,8. Dessa bevislinjer tyder på att utvecklingen av miRNA-efterlikningar eller inhibitorer leveranssystem för njuren krävs för att möjliggöra deras användning i kliniska miljöer och göra dem till ett nytt behandlingsalternativ för patienter med olika njursjukdomar.
Virala vektorer har använts som bärare för att leverera exogena miRNA-härmar eller hämmare till njuren 9,10. Även om de har utvecklats för biosäkerhet och transfektionseffekt kan virala vektorer fortfarande orsaka interferonrespons och/eller genetisk instabilitet11,12. För att övervinna dessa problem utvecklade vi ett miRNA-efterliknande leveranssystem för njurarna med hjälp av polyetyleniminnanopartiklar (PEI-NP), en icke-viral vektor, i flera musmodeller av njursjukdom13,14,15.
PEI-NP är linjära polymerbaserade NP som effektivt kan leverera oligonukleotider, inklusive miRNA-efterlikningar, till njurarna och anses vara att föredra för framställning av icke-virala vektorer på grund av deras långsiktiga säkerhet och biokompatibilitet13,16,17.
Denna studie visar effekterna av systematiska exogena miRNA-efterliknar leverans med PEI-NPs via svansveninjektion hos njurfibrosmodellmöss producerade av ensidig urinledarobstruktion (UUO). Dessutom demonstrerar vi effekterna av systematisk exogen miRNA-mimisk leverans med PEI-NPs via svansveninjektion hos diabetiska njursjukdomsmodellmöss (db / db-möss: C57BLKS / J Iar -+Lepr db / + Leprdb) och akuta njurskademodellmöss producerade av njurischemi-reperfusionsskada (IRI).
Protocol
Representative Results
Discussion
Med hjälp av protokollet som presenteras i detta manuskript kan PEI-NPs leverera miRNA-efterlikningar till njurarna för att inducera överuttryck av mål-miRNA, vilket resulterar i behandlingseffekter i in vivo-musmodeller av flera njursjukdomar, inklusive njurfibros, diabetisk njursjukdom och AKI.
Metoden för att förbereda komplexet av PEI-NP och miRNA-efterlikning är mycket enkel. Den positivt laddade ytan av PEI-NPs fångar miRNA-efterlikningen när de bara blandas 13,14,15,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI (bidrag nr 21K08233). Vi tackar Edanz (https://jp.edanz.com/ac) för redigeringen av utkast till detta manuskript.
Materials
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
