عزل وتوصيف الخلايا البطانية الشريانية المساريقية الأولية البشرية على مستوى النسخ
Summary
يصف البروتوكول عزل الخلايا البطانية وزراعتها وتوصيفها من الشريان المساريقي البشري. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير طريقة لإعداد الشريان البشري للنسخ المكاني. يمكن إجراء البروتيوميات والنسخ والفحوصات الوظيفية على الخلايا المعزولة. يمكن إعادة استخدام هذا البروتوكول لأي شريان متوسط أو كبير الحجم.
Abstract
الخلايا البطانية (ECs) ضرورية لوظيفة الأوعية الدموية والجسم كله من خلال استجابتها الديناميكية للإشارات البيئية. يعد توضيح النسخ و epigenome من ECs أمرا بالغ الأهمية لفهم أدوارها في التنمية والصحة والمرض ، ولكنه محدود في توافر الخلايا الأولية المعزولة. وقد مكنت التكنولوجيات الحديثة من التنميط عالي الإنتاجية لنسخ EC و epigenome ، مما أدى إلى تحديد المجموعات الفرعية لخلايا EC غير المعروفة سابقا ومسارات النمو. في حين أن ثقافات EC هي أداة مفيدة في استكشاف وظيفة EC والخلل الوظيفي ، فإن ظروف الثقافة والممرات المتعددة يمكن أن تقدم متغيرات خارجية تغير خصائص EC الأصلية ، بما في ذلك المورفولوجيا والحالة اللاجينية وبرنامج التعبير الجيني. للتغلب على هذا القيد ، توضح هذه الورقة طريقة لعزل ECs الأولية البشرية عن الشرايين المساريقية المانحة التي تهدف إلى التقاط حالتها الأصلية. يتم فصل ECs في الطبقة الداخلية ميكانيكيا وكيميائيا حيويا باستخدام إنزيمات معينة. يمكن استخدام الخلايا الناتجة مباشرة للحمض النووي الريبي السائب أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو مطلي للزراعة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف سير العمل لإعداد الأنسجة الشريانية البشرية للنسخ المكاني ، وتحديدا لمنصة متاحة تجاريا ، على الرغم من أن هذه الطريقة مناسبة أيضا لتقنيات التنميط المكاني الأخرى. يمكن تطبيق هذه المنهجية على الأوعية المختلفة التي تم جمعها من مجموعة متنوعة من المانحين في الحالات الصحية أو المرضية لاكتساب رؤى ثاقبة حول التنظيم النسخي واللاجيني EC ، وهو جانب محوري في بيولوجيا الخلايا البطانية.
Introduction
بطانة تجويف الأوعية الدموية ، الخلايا البطانية (ECs) هي منظمات حاسمة للنغمة الوعائية وتروية الأنسجة. ECs رائعة في قدرتها على التفاعل مع البيئة خارج الخلية والتكيف مع التغيرات في ديناميكيات وتكوين تدفق الدم. يتم التوسط في هذه الاستجابات الديناميكية من خلال شبكة من أحداث الإشارات داخل الخلايا ، بما في ذلك التعديلات النسخية وما بعد النسخ بدقة مكانية زمانية. وينطوي خلل تنظيم هذه الاستجابات على العديد من الأمراض، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر أمراض القلب والأوعية الدموية والسكري والسرطان 1,2.
تستخدم نسبة كبيرة من الدراسات خطوط الخلايا أو النماذج الحيوانية لاستجواب نسخ EC. الأول هو أداة مفيدة ، بالنظر إلى سهولة الاستخدام النسبية وعدم التكلفة. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي الاستزراع التسلسلي إلى إدخال تغييرات مظهرية على ECs ، مثل ميزات الخلايا الليفية ونقص الاستقطاب ، وفصلها عن حالتها في الجسم الحي 3. كانت الخلايا الأولية ، على سبيل المثال ، الوريد السري البشري EC (HUVEC) خيارا شائعا منذ 1980s ولكنها مشتقة من سرير وعائي تنموي غير موجود لدى البالغين ، وبالتالي من غير المرجح أن يمثل ECs الناضجة بالكامل. تمثل الحيوانات ، وخاصة نماذج الفئران ، البيئة الفسيولوجية أو الفسيولوجية المرضية ل ECs بشكل أفضل وتسمح باستجواب النسخ نتيجة للاضطراب الوراثي. يمكن عزل Murine ECs من الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الشريان الأورطي والرئتين والأنسجة الدهنية باستخدام الإجراءات القائمة على الإنزيم4،5،6،7. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام الخلايا المعزولة لممرات متعددة ما لم يتم تحويلها6 وغالبا ما تكون محدودة في الأعداد ، مما يتطلب تجميعها من متعددة5،8،9.
إن ظهور تقنيات جديدة تستكشف بنية الأوعية على مستوى النسخ ، خاصة مع دقة الخلية الواحدة ، قد مكن من عصر جديد من البيولوجيا البطانية من خلال الكشف عن وظائف وخصائص جديدة ل ECs 5,10,11,12,13,14. جمع مورد غني بناه محققو Tabula Muris ملفات تعريف نسخية أحادية الخلية ل 100000 خلية بما في ذلك ECs عبر 20 عضوا فئوريا مختلفا15 ، والتي كشفت عن كل من جينات علامة EC الشائعة والتوقيعات النسخية الفريدة مع الاختلافات بين الأنسجة وداخلها 5,13. ومع ذلك ، هناك اختلافات واضحة بين الفأر والإنسان في الجينوم ، epigenome ، و transcriptome ، خاصة في المناطق غير المشفرة16،17،18. تؤكد هذه العيوب المذكورة أعلاه على أهمية تحليل ECs باستخدام عينات بشرية من أجل الحصول على ملف تعريف أمين لل ECs في حالتها الأصلية في الصحة والمرض.
تعتمد معظم طرق عزل EC على التفكك الجسدي من خلال التجانس والقطع الدقيق وفرم الأنسجة قبل الحضانة بالإنزيمات المحللة للبروتين لأوقات مختلفة. تختلف الإنزيمات والظروف أيضا اختلافا كبيرا بين أنواع الأنسجة ، من التربسين إلى الكولاجيناز ، المستخدمة بمفردها أو في تركيبة19،20،21. غالبا ما يتم تضمين المزيد من التخصيب أو التنقية القائمة على الأجسام المضادة لزيادة نقاء ECs. عادة ، يتم اقتران الأجسام المضادة ضد علامات غشاء EC ، على سبيل المثال ، CD144 و CD31 بالخرز المغناطيسي وتضاف إلى تعليق الخلية22,23. يمكن تكييف هذه الاستراتيجية بشكل عام لعزل EC عن الأنسجة البشرية والفئران المتعددة ، بما في ذلك التقنيات التي تم إدخالها في هذا البروتوكول.
في حالتها الأصلية ، تتفاعل ECs مع أنواع متعددة من الخلايا وقد توجد في منافذ الأوعية الدموية حيث يكون قرب الخلية أمرا بالغ الأهمية للوظيفة. في حين أن دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنووية الواحدة (scRNA و snRNA-seq) كانت ذات أهمية قصوى للاختراقات الأخيرة في وصف عدم تجانس EC ، فإن عملية التفكك تعطل سياق الأنسجة واتصال الخلايا الخلوية ، والتي هي أيضا مهمة لفهم بيولوجيا EC. تم تطوير التنميط المكاني في عام 2012 وأطلق عليه اسم طريقة العام في عام2020 24 ، وقد تم استخدام التنميط المكاني لتحديد ملامح التعبير الجيني العالمي مع الاحتفاظ بالسمات المكانية في الأنسجة المختلفة بما في ذلك الدماغ 25 والورم26 والأنسجة الدهنية27. يمكن استهداف التقنيات ، باستخدام مجسات متخصصة خاصة بتسلسلات الحمض النووي الريبي الخاصة المرتبطة بكواشف التقارب أو علامات الفلورسنت ، وبالتالي اكتشاف جينات مختارة بدقة دون خلوية28،29،30،31. يمكن أيضا أن تكون غير مستهدفة32,33 ، وعادة ما تستخدم oligonucleotides المشفرة مكانيا لالتقاط الحمض النووي الريبي ، والتي يتم تحويلها معا إلى cDNA لإعداد مكتبة seq اللاحقة ، وبالتالي لديها ميزة استنتاج التعبير الجيني للأنسجة بأكملها بطريقة غير متحيزة. ومع ذلك، لا يتم حاليا تحقيق الاستبانة المكانية على مستوى خلوي واحد باستخدام التكنولوجيات المتاحة تجاريا. يمكن التغلب على ذلك إلى حد ما من خلال تكامل البيانات مع بيانات scRNA-seq ، مما يسمح في النهاية برسم خرائط لنسخ الخلية الواحدة في سياق الأنسجة المعقدة مع الاحتفاظ بمعلوماتها المكانية الأصلية34.
هنا ، يتم وصف سير العمل لملف تعريف EC transcriptome باستخدام الشريان المساريقي البشري العلوي ، وهو شريان محيطي تم استخدامه لدراسة توسع الأوعية الدموية ، وإعادة تشكيل الأوعية الدموية ، والإجهاد التأكسدي ، والالتهاب35،36،37. يتم وصف تقنيتين: 1) لعزل وإثراء ECs من داخل الأوعية الدموية التي تجمع بين التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي المناسب لتسلسل النسخ أحادي الخلية أو في الثقافة المختبرية اللاحقة ؛ 2) إعداد أقسام الشرايين للتنميط المكاني (الشكل 1). يمكن تنفيذ هاتين التقنيتين بشكل مستقل أو متكامل لتحديد ملامح ECs والخلايا المحيطة بها. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف سير العمل هذا للاستخدام على أي شريان متوسط أو كبير.
Protocol
Representative Results
Discussion
يفصل سير العمل المقدم مجموعة من التقنيات لتحديد ملامح ECs من قطعة واحدة من الشريان البشري بدقة أحادية الخلية ومكانية. هناك العديد من الخطوات الحاسمة والعوامل المقيدة في البروتوكول. أحد مفاتيح التنميط النصفي هو نضارة الأنسجة وسلامة الحمض النووي الريبي. من المهم الحفاظ على الأنسجة على الجلي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01HL108735 و R01HL145170 و R01HL106089 (إلى Z.B.C.) ؛ DP1DK126138 و DP1HD087990 (إلى S.Z.) ؛ منحة مؤسسة إيلا فيتزجيرالد ومشروع عائلة وانيك (إلى Z.B.C.) ؛ ومنحة شبكة بذور أطلس الخلايا البشرية (إلى Z.B.C. و S.Z.). شملت الأبحاث الواردة في هذا المنشور العمل المنجز في مركز الجينوم التكاملي في مدينة الأمل بدعم من المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة P30CA033572. يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور إسماعيل العبد الله والدكتور ميريجنغ تشي من فريق زراعة الجزر في مدينة الأمل لعزل الأنسجة البشرية ، والدكتور دونغتشيانغ يوان في مدينة الأمل على مساعدته في تحليل scRNA-seq ، والدكتور مارك هالوشكا في قسم أمراض القلب والأوعية الدموية ، كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز على رؤاه القيمة في علم الأنسجة الوعائية.
Materials
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , 1-38 (2007).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
- Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
- Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
- Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
- Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
- Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
- Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
- Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
- The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
- Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
- Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
- Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
- McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
- Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
- Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
- Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
- Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
- Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
- Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
- Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
- Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
- Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
- Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
- Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
- Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
- Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
- Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
- Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
- Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
- van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
- Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
- Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
- Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).
