कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च अस्थायी संकल्प के साथ माउस न्यूरोमस्कुलर जंक्शन में कैल्शियम ट्रांजिएंट्स का पंजीकरण
Summary
प्रोटोकॉल माउस मोटर तंत्रिका टर्मिनलों में कट तंत्रिका के माध्यम से फ्लोरोसेंट कैल्शियम डाई लोड करने की विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके परिधीय तंत्रिका अंत में तेजी से कैल्शियम क्षणिकों को रिकॉर्ड करने के लिए एक अनूठी विधि प्रस्तुत की जाती है।
Abstract
प्रीसिनेप्टिक कैल्शियम स्तर का अनुमान सिनैप्टिक ट्रांसमिशन का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण कार्य है क्योंकि प्रीसिनेप्टिक सेल में कैल्शियम प्रवेश न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के लिए अग्रणी घटनाओं के झरना को ट्रिगर करता है। इसके अलावा, प्रीसिनेप्टिक कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन कई इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की गतिविधि की मध्यस्थता करते हैं और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के इलाज के तरीके खोजने के लिए कैल्शियम सिग्नलिंग का अध्ययन करना भी महत्वपूर्ण है। न्यूरोमस्कुलर जंक्शन सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल है, क्योंकि इसमें केवल एक प्रकार का न्यूरोट्रांसमीटर है। यह लेख चूहों के मोटर तंत्रिका अंत में कट तंत्रिका बंडल के माध्यम से कैल्शियम-संवेदनशील डाई लोड करने की विधि का वर्णन करता है। यह विधि इंट्रासेल्युलर कैल्शियम परिवर्तनों से संबंधित सभी मापदंडों के अनुमान की अनुमति देती है, जैसे बेसल कैल्शियम स्तर और कैल्शियम क्षणिक। चूंकि कोशिका के बाहरी हिस्से से तंत्रिका टर्मिनलों में कैल्शियम की आमद और कैल्शियम-संवेदनशील डाई के लिए इसके बंधन / अनबाध्यकारी कुछ मिलीसेकंड की सीमा के भीतर होते हैं, इसलिए इन घटनाओं को रिकॉर्ड करने के लिए एक त्वरित इमेजिंग सिस्टम की आवश्यकता होती है। दरअसल, हाई-स्पीड कैमरों का उपयोग आमतौर पर तेजी से कैल्शियम परिवर्तनों के पंजीकरण के लिए किया जाता है, लेकिन उनके पास कम छवि रिज़ॉल्यूशन पैरामीटर होते हैं। कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग के लिए यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान किए गए बेहद अच्छे स्थानिक-अस्थायी संकल्प की अनुमति देता है।
Introduction
उत्तेजक कोशिकाओं में तेजी से कैल्शियम तरंगों को मापने की समस्या केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र में सिग्नल ट्रांसमिशन का अध्ययन करने के सबसे महत्वपूर्ण और चुनौतीपूर्ण पहलुओं में से एक है। कैल्शियम आयन न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी और विभिन्न इंट्रासेल्युलर प्रोटीन 1,2,3,4,5 की गतिविधि के मॉड्यूलेशन को ट्रिगर करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के इलाज के तरीके खोजने के लिए कैल्शियम सिग्नलिंग का अध्ययन करना भी महत्वपूर्ण है6. कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन को मापने के लिए, फ्लोरोसेंट कैल्शियम-संवेदनशील रंगों का आमतौर पर उपयोग किया जाता है, और उनके प्रतिदीप्ति स्तर में परिवर्तनका विश्लेषण 7,8,9 किया जाता है।
कोशिकाओं में कैल्शियम रंगों की लोडिंग को विभिन्न तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है। मुख्य रूप से, सेल-परमेंट रंगों का उपयोग10,11 किया जाता है। हालांकि, ऐसे मामले में, सेल के अंदर डाई की एकाग्रता को नियंत्रित करना न केवल मुश्किल है, बल्कि लोडिंग के लिए लक्ष्य कोशिकाओं का चयन करना भी मुश्किल है। यह विधि परिधीय तंत्रिका अंत का अध्ययन करने के लिए लागू नहीं है क्योंकि डाई पोस्टसिनेप्टिक कोशिकाओं में प्रवेश करती है। इसके बजाय, सेल अभेद्य रंग ऐसी तैयारी के लिए अधिक उपयुक्त हैं। इस मामले में, रंगों को माइक्रोइंजेक्शन द्वारा या पैच पिपेट12,13,14 के माध्यम से कोशिकाओं तक पहुंचाया जाता है। तंत्रिका स्टंप के माध्यम से लोड करने की एक विधि भी है। बाद की विधि न्यूरोमस्कुलर जंक्शन तैयारी 15,16,17,18,19,20 के लिए सबसे उपयुक्त है। यह केवल ब्याज की कोशिकाओं के लिए धुंधला प्रदर्शन करने की अनुमति देता है। यद्यपि यह विधि लक्ष्य सेल में डाई की एकाग्रता का सटीक मूल्यांकन प्रदान नहीं करती है, लेकिन कैल्शियम21 की ज्ञात एकाग्रता के साथ समाधान में आराम से कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति के स्तर की तुलना करके एकाग्रता का अनुमान लगाया जा सकता है। इस अध्ययन में, स्तनधारियों के सिनैप्स पर लागू इस पद्धति का एक संशोधन प्रस्तुत किया गया है।
एक्शन पोटेंशिअल के विध्रुवण चरण के दौरान कैल्शियम प्रविष्टि एक तेज़ प्रक्रिया है, खासकर न्यूरोमस्कुलर जंक्शन में; इसलिए, इसके पंजीकरण के लिए, उपयुक्त उपकरण की आवश्यकता होती है1. वोल्टेज-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि माउस के परिधीय अन्तर्ग्रथन में एक्शन पोटेंशिअल की अवधि लगभग 300 μs22 है। कैल्शियम क्षणिक, मेंढक के परिधीय सिनैप्स में कैल्शियम-संवेदनशील रंगों का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है, इसकी लंबी अवधि होती है: वृद्धि का समय लगभग 2-6 एमएस होता है और क्षय का समय लगभग 30-90 एमएस होता है, जो कैल्शियम डाई के आधार पर23,24 होता है। फ्लोरोसेंट रंगों की मदद से तेज प्रक्रियाओं को मापने के लिए, सीसीडी या सीएमओएस कैमरों का उपयोग आमतौर पर तेज और संवेदनशील सीसीडी मैट्रिक्स के साथ किया जाता है। हालांकि, इन कैमरों में कम रिज़ॉल्यूशन का नुकसान होता है, जो मैट्रिक्स25,26,27,28 के संवेदनशील तत्वों के आकार से सीमित होता है। कोशिकाओं की कम आवृत्ति उत्तेजना के जवाब में एक्शन पोटेंशिअल और कैल्शियम ट्रांजिएंट दोनों को रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता वाले सबसे तेज़ कैमरों में 2,000 हर्ट्ज की स्कैनिंग आवृत्ति होती है, और 80 x 8029 के आयाम के साथ एक मैट्रिक्स होता है। उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ सिग्नल प्राप्त करने के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है, खासकर यदि सिग्नल30,31,32 में कुछ वॉल्यूमेट्रिक परिवर्तनों का आकलन करना आवश्यक है। लेकिन यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में लाइन स्कैन मोड में उच्च स्कैनिंग गति है, लेकिन स्थानिक छवि33 का निर्माण करते समय तेज प्रक्रियाओं की रिकॉर्डिंग की गति पर अभी भी महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। घूर्णन निप्पको डिस्क (स्लिट-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी) और मल्टीपॉइंट-ऐरे स्कैनर के आधार पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप हैं, जिनमें उच्च स्कैनिंग गति है। इसी समय, वे कॉन्फोकल इमेज फ़िल्टरिंग में शास्त्रीय कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप से नीच हैं (एक निपको डिस्क के साथ माइक्रोस्कोप के लिए पिनहोल क्रॉसस्टॉक) 32,34,35। अनुनाद स्कैनिंग के साथ कॉन्फोकल इमेजिंग भी उच्च अस्थायी माप36 के लिए आवश्यक एक उच्च स्थानिक-अस्थायी संकल्प प्रदान कर सकता है। हालांकि, ध्यान रखें कि अनुनाद स्कैनर का उपयोग करते समय उच्च स्कैनिंग गति पर कमजोर फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं के पंजीकरण के लिए हाइब्रिड डिटेक्टरों जैसे अत्यधिक संवेदनशील डिटेक्टरों की आवश्यकता होती है36.
यह आलेख स्थानिक रिज़ॉल्यूशन37 को बनाए रखते हुए लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एलएससीएम) के साथ दर्ज संकेतों के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। वर्तमान विधि पहले वर्णित विधियों का एक और विकास है और एलएससीएम प्लेटफॉर्म 38,39,40 में स्थानांतरित कर दिया गया है। इस दृष्टिकोण को माइक्रोस्कोप हार्डवेयर में परिवर्तन की आवश्यकता नहीं होती है और उत्तेजना के क्षण के सापेक्ष समय-समय पर फ्लोरोसेंट संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए एक एल्गोरिथ्म के आवेदन पर आधारित होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीए2 + संवेदनशील डाई को तंत्रिका स्टंप के माध्यम से माउस तंत्रिका अंत में लोड करने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके तेजी से कैल्शियम क्षणिक पंजीकृत करने की विधि इस लेख में प्रस्तुत की गई है। ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम का प्रतिदीप्ति अध्ययन रूसी विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (परियोजना संख्या 19-15-00329) की वित्तीय सहायता के साथ किया गया था। विधि को एफआरसी कज़ान वैज्ञानिक केंद्र के लिए सरकारी असाइनमेंट से वित्तपोषण के तहत विकसित किया गया था आरएएस-ओ 18-118022790083-9। अनुसंधान को संघीय अनुसंधान केंद्र “आरएएस के कज़ान वैज्ञानिक केंद्र” के उपकरणों के उपयोग के साथ विकसित किया गया था। लेखक इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ विक्टर आई इलिन को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Capillary Glass | Clark Electromedical instruments, UK | GC150-10 | |
| Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems , Heidelberg, Germany | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 | Sutter Instrument, USA | P-97 | |
| Flow regulator | KD Medical GmbH Hospital Products, Germany | KD REG | Disposable infusion set with Flow regulator |
| HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100mL |
| Illumination system Leica CLS 150X | Leica Microsystems, Germany | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Las AF software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | ||
| Las X software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Magnetic Holder with Suction Tubing | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Latvia | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | Fine science tools, Canada | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latvia | BS-010205-AAN | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt | Molecular Probes, USA | O6806 | 500 μg |
| Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10 µL |
| Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10 µL |
| Plasticine | local producer | ||
| Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40 mm |
| Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel | |
| Stereomicroscope, Leica M80 | Leica Microsystems , Germany | ||
| Suction electrode | Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. – No. 9 (40) Part 3. – P. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning, USA | ||
| Syringe | local producer | 0.5 mL | |
| Syringe | local producer | 60 mL |
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