一种研究炎症期间白细胞-内皮细胞相互作用的微生理系统
Summary
在该协议中，仿生微流体测定法可用于研究炎症性疾病中的白细胞 – 内皮细胞相互作用，该测定可以再现生理相关的微血管环境并重现整个白细胞粘附/迁移级联反应。
Abstract
白细胞 – 内皮细胞相互作用在脓毒症等炎症性疾病中起重要作用。在炎症期间，活化的白细胞通过血管内皮过度迁移到关键器官可导致器官衰竭。已经使用几种实验和计算技术开发和验证了生理相关的仿生微流体测定（bMFA），该技术可以重现整个白细胞滚动/粘附/迁移级联反应，以研究白细胞 – 内皮细胞相互作用。使用地理信息系统（GIS）方法对从啮齿动物 体内 图像获得的微血管网络进行数字化，并在显微镜载玻片上用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行微加工。为了研究剪切速率和血管拓扑结构对白细胞 – 内皮细胞相互作用的影响，开发了计算流体动力学（CFD）模型以生成整个网络的剪切速率和速度的相应图。bMFA能够量化白细胞 – 内皮细胞相互作用，包括滚动速度，响应于不同剪切速率的粘附白细胞数量，迁移白细胞数量，内皮细胞通透性，粘附分子表达和其他重要变量。此外，通过使用人相关样品，如人内皮细胞和白细胞，bMFA为快速筛选潜在疗法提供了一种工具，以提高其临床转化性。
Introduction
炎症是宿主对感染和损伤的反应，内皮在炎症反应中起重要作用1，2，3。炎症失调是许多疾病病理学的根本原因，例如败血症，心血管疾病，哮喘，炎症性肠病，癌症和COVID-19。白细胞 – 内皮细胞相互作用在这些炎症性疾病中起核心作用。在炎症过程中，从病原体释放的PAMPS（病原体相关分子模式）或从受损组织中释放的DAMPS（损伤相关分子模式）激活免疫细胞释放细胞因子/趋化因子和其他促炎介质，导致内皮激活，导致血管内皮屏障功能改变和通透性增加3，4.炎症期间内皮细胞的活化增加导致白细胞 – 内皮细胞相互作用增强，导致活化的白细胞过度迁移穿过血管内皮进入关键器官1，5，6，7。
白细胞的募集是由由生物活性脂质，细胞因子，趋化因子和补体组分8，9组成的化学多样性化学吸引剂引起的。白细胞募集是一个多步骤的过程，包括五个独立的步骤：1）白细胞切缘和捕获/附着，2）滚动，3）牢固的阻止，4）扩散和爬行以及5）外渗/迁移（图1）。该过程的每一步都需要白细胞和内皮细胞之间的串扰来协调这种动态现象1，9。最终，停滞的白细胞通过由并发的化学吸引剂依赖性信号，粘附事件和血流动力学剪切力1，9，10，11，12控制的多步骤过程外渗到内皮的发炎组织。
鉴于剪切应力在调节内皮细胞功能中的核心作用以及白细胞 – 内皮细胞相互作用的重要性13，在过去的几十年中已经开发了几种 体外 模型来研究白细胞迁移级联的各个方面在更可控的环境中14。研究白细胞- 内皮细胞相互作用的传统流体装置可分为两大类14：a）用于研究白细胞滚动，粘附和粘附分子表达的装置，例如平行板流室和b）用于研究在静态条件下的白细胞迁移的装置，例如透孔室。平行板流室等系统已被用于研究粘附分子及其配体在剪切力15下粘附级联中的作用。然而，一个显著的缺点是这些简单化、理想化的装置（例如，直通道）不能再现 体内 微脉管系统的规模和几何形状（例如，连续的血管分岔、血管形态）和由此产生的流动条件（例如，分岔处的汇聚或发散流动）。因此，这些设备只能模拟粘附，而不能模拟迁移。透孔室只能研究静态条件下的迁移，而不考虑 体内 几何特征和流动条件。因此，这些传统模型不模仿活组织的微环境或在单个测定6中解析粘附和迁移级联反应。
为了解决这一限制，我们开发并广泛验证了一种新的3D仿生微流体测定（bMFA）（图2），该测定在芯片16，17，18上实际再现体内微血管网络。该器件的微加工协议先前已于17发布，此处仅简要介绍。使用改进的地理信息系统（GIS）方法对小鼠cremaster肌肉的微血管系统进行数字化19。然后，使用基于数字化微血管网络14，17，20，21，22的软光刻工艺在聚二甲基硅氧烷（PDMS）上生成合成的微血管网络。简而言之，将数字化的网络图像打印在Mylar胶片上，然后将其用作掩模，在硅晶圆上图案SU-8正光刻胶，以创建用于制造的母带。微加工柱（直径10μm，高3μm）用于创建3μm高，100μm宽的孔，白细胞迁移的最佳尺寸23，24，25，连接血管通道和组织室。PDMS是根据制造商的说明准备的，并浇注在开发的母版上。此外，PDMS脱气并允许在烘箱（65°C）中固化过夜，以在PDMS中产生互补的微通道。随后，固化的PDMS从SU-8主站剥离，然后是入口/出口的冲孔端口。然后，PMDS等离子体粘合到载玻片上。微流体装置的表面包括天然玻璃和PDMS。为了促进细胞附着，扩散和增殖，需要细胞外基质（ECM）包衣。bMFA包括一个微血管网络和一个通过3μm高和100μm宽的孔连接的组织室（图2）。该微流体系统在具有相互连接的血管和分叉的完整微血管网络的生理相关3D环境中再现整个白细胞粘附/迁移级联反应，包括循环，边缘化，滚动，粘附和白细胞在单个系统14，16，17，21，26中进入血管外组织室。
需要注意的是，即使bMFA入口处的流速是固定的，网络中的流动条件在不同位置也不同，无法通过简单的数学公式计算。开发了一个基于计算流体动力学（CFD）的模型来计算网络中不同位置的不同流动参数（例如，剪切应力，剪切速率，速度）。该CFD模型用于模拟bMFA中的染料灌注模式和流动参数。与实验结果的交叉验证表明，计算模型可以很好地预测整个网络的流动阻力（图3）17。然后使用该CFD模型来估计bMFA每个容器中的速度和剪切速率曲线（图4），从而可以分析剪切流和几何形状对白细胞滚动，粘附和迁移的影响16。白细胞优先粘附在分岔附近和体内低剪切区域，并且使用嗜中性粒细胞在bMFA中成功证明了白细胞粘附的空间模式（图5）16。本文描述了制备bMFA以使用人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）和人嗜中性粒细胞在炎症条件下研究白细胞 – 内皮细胞相互作用的方案。微生理系统，如bMFA，可用于研究内皮细胞与不同类型的细胞如嗜中性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞和肿瘤细胞18，27，28，29，30的相互作用。bMFA可以接种来自不同器官（例如，肺与脑）和不同物种（例如，人与鼠内皮细胞）的原代内皮细胞，以及内皮细胞系21，27，31，32。bMFA可用于研究多种细胞反应，细胞 – 细胞相互作用，屏障功能，药物递送和药物毒性。
Protocol
Representative Results
Discussion
bMFA再现体内微血管网络的形貌和流动条件，可用于 在 生理现实条件下研究白细胞 – 内皮细胞相互作用和 体外 内皮功能。在小鼠或人类的微血管系统中，微血管网络的几何形状是自相似和分形的，雷诺数<<1，表明血管几何形状不会显着影响流动模式。因此，bFMA可用于研究包括人类在内的不同物种的白细胞 – 内皮相互作用，尽管小鼠cremaster肌肉的微脉管系统被映射以制造bMFA。
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持，拨款号：GM114359和GM134701（M.F.K.和L.E.K.），1F31AI164870-01（J.C.L.）和国防威胁减少局，拨款号：HDTRA11910012（M.F.K.和L.E.K.）。
Materials
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
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