تحليل نموذج فأر مرض باركنسون الناجم عن ناقلات الفيروسات المرتبطة بالأدينو التي تشفر α-سينوكلين البشري
Summary
يحلل هذا العمل جرعة الناقل ووقت التعرض اللازم للحث على التهاب الأعصاب والتنكس العصبي والإعاقة الحركية في هذا النموذج قبل السريري لمرض باركنسون. يتم تسليم هذه النواقل التي تشفر α-سينوكلين البشري إلى المادة السوداء لتلخيص أمراض سينوكلين المرتبطة بمرض باركنسون.
Abstract
مرض باركنسون هو اضطراب تنكسي عصبي ينطوي على موت الخلايا العصبية الدوبامينية في المسار الزنجي ، وبالتالي ، الفقدان التدريجي للسيطرة على الحركات الطوعية. يتم تشغيل هذه العملية العصبية التنكسية عن طريق ترسب مجاميع البروتين في الدماغ ، والتي تتكون أساسا من α-سينوكلين. أشارت العديد من الدراسات إلى أن الالتهاب العصبي مطلوب لتطوير التنكس العصبي المرتبط بمرض باركنسون. والجدير بالذكر أن العملية الالتهابية العصبية تنطوي على تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة وكذلك تسلل الخلايا التائية الطرفية إلى المادة السوداء (SN). يحلل هذا العمل نموذج الفأر لمرض باركنسون الذي يلخص تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ، وتسلل الخلايا التائية إلى SN ، والتنكس العصبي للخلايا العصبية الدوبامينية النيجيرية ، والإعاقة الحركية. يتم تحفيز نموذج الفأر هذا لمرض باركنسون من خلال التسليم المجسمة للناقلات الفيروسية المرتبطة بالغدية التي تشفر α-سينوكلين (AAV-hαSyn) من النوع البري البشري في SN. وتم تأكيد التوصيل الصحيح للنواقل الفيروسية إلى SN باستخدام نواقل المكافحة التي تشفر البروتين الفلوري الأخضر (GFP). بعد ذلك ، كيف أثرت جرعة AAV-hαSyn التي تم إعطاؤها في SN على مدى تعبير hαSyn ، وفقدان الخلايا العصبية الدوبامينية النيجيرية ، والضعف الحركي. علاوة على ذلك ، تم تحديد ديناميكيات تعبير hαSyn ، والتنشيط الدبقي الصغير ، وتسلل الخلايا التائية طوال الفترة الزمنية لتطور المرض. وبالتالي ، توفر هذه الدراسة نقاطا زمنية حرجة قد تكون مفيدة لاستهداف أمراض سينوكلين والالتهاب العصبي في هذا النموذج قبل السريري لمرض باركنسون.
Introduction
بعد مرض الزهايمر ، يعد مرض باركنسون ثاني أكثر الأمراض العصبية التنكسية انتشارا في جميع أنحاء العالم. الخلايا العصبية الأولية المتأثرة بمرض باركنسون هي تلك الموجودة في المسار nigrostriatal ، والتي تنتج الدوبامين وتتحكم في الحركة الطوعية. ونتيجة لذلك ، فإن أكثر الأعراض المميزة المرتبطة بهذا الاضطراب هي الإعاقة الحركية. يتضمن هذا المرض أيضا ترسب مجاميع البروتين في الدماغ ، والتي تتكون أساسا من α-سينوكلين (αSyn)1 ، وهو بروتين خلوي مرتبط بأطراف ما قبل المشبكي. وقد أظهرت الأدلة أن توليد الشوائب المسببة للأمراض من αSyn يتم تشغيله عن طريق سوء الطي أو عن طريق بعض التعديلات بعد الترجمة لهذا البروتين2.
والجدير بالذكر أنه تم تأسيس علاقة وثيقة بين علم الأمراض αSyn وفقدان الخلايا العصبية الدوبامينية للمسار nigrostriatal في مرض باركنسون البشري والنماذج الحيوانية 3,4. يمثل فهم كيفية توليد مجاميع αSyn وكيف تحفز موت الخلايا العصبية تحديا كبيرا في هذا المجال. أظهرت مجموعة متزايدة من الدراسات أنه من خلال زيادة الإجهاد التأكسدي ، يعد خلل الميتوكوندريا أحد الأسباب الرئيسية لتوليد مجاميع αSyn2. في الواقع ، العديد من الجينات المرتبطة بخطر مرض باركنسون تشفر البروتينات المشاركة في وظيفة الميتوكوندريا ، والمورفولوجيا ، والديناميكيات 5,6. بالإضافة إلى ذلك ، يشكل الخلل الوظيفي في الليزوزومات ، والذي يؤدي إلى تراكم الميتوكوندريا المختلة وظيفيا و αSyn غير المطوي بشكل خاطئ حدثا رئيسيا آخر يعزز توليد مجاميع αSyn7.
وقد أشارت الأدلة الناشئة إلى أنه بمجرد ترسب مجاميع αSyn في الدماغ ، فإن هذه البروتينات المسببة للأمراض تحفز المستقبلات الشبيهة بالرسوم (TLRs) على الخلايا الدبقية الصغيرة ، وبالتالي تؤدي إلى تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة وبيئة التهابية أولية في المادة السوداء (SN) 8,9. علاوة على ذلك ، تشير الأدلة إلى أن مجاميع αSyn يتم التقاطها وتقديمها بواسطة الخلايا التي تقدم المستضدات إلى الخلايا التائية ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية تكيفية خاصة ب αSyn10,11. هذه الخلايا التائية الخاصة ب αSyn تتسلل لاحقا إلى الدماغ ويتم إعادة تحريكها بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة ، وبالتالي تعزيز إفراز العوامل السمية العصبية التي تثير الموت العصبي 9,10. ومن المثير للاهتمام ، أن العديد من خطوط الأدلة قد اقترحت أن مجاميع αSyn يتم توليدها أولا في الجهاز العصبي المعوي ثم يتم نقلها عبر العصب المبهم إلى جذع الدماغ12.
تم استخدام العديد من النماذج الحيوانية لمرض باركنسون لسنوات عديدة ، بما في ذلك تلك الناجمة عن إعطاء المواد السامة للأعصاب (أي 6-هيدروكسي دوبامين ، باراكوات ، روتينون ، 1-ميثيل-4-فينيل-1،2،3،6-رباعي هيدروبيريدين) وتلك التي تنطوي على حالات وراثية (أي α-سينوكلين المتحور ، كيناز متكرر غني بالليوسين المتحور 2)13 . على الرغم من أن النماذج التي تنطوي على تنكس عصبي ناجم عن السموم العصبية تكرر بعض جوانب مرض باركنسون ، إلا أن أيا منها لا يلخص جميع الجوانب الأساسية للمرض أو ليست تقدمية13. من ناحية أخرى ، على الرغم من أن نماذج الفئران الجينية التي تنطوي على التعبير عن نسخ متحولة من كيناز 2 المتكرر الغني بالليوسين ، أو الإصدارات المتحولة من α-سينوكلين ، أو الإفراط في التعبير عن α-سينوكلين البشري من النوع البري تؤدي إلى ضعف حركي ، وفي بعض الحالات ، أيضا تطور اعتلال سينوكلينولين ، فإنها لا تتكاثر تنكسا عصبيا بارزا للخلايا العصبية الدوبامينية النيجيرية ، وهو جانب أساسي من مرض باركنسون13 ، 14. تمكن نوع ثالث من النماذج الحيوانية للتنكس العصبي من تلبية معظم الجوانب الأساسية لمرض باركنسون ، وهو التسليم المجسمة للناقلات الفيروسية المرتبطة بالغدية (AAVs) التي تشفر α-سينوكلين البشري (AAV-hαSyn) 14,15. الأهم من ذلك ، تسمح AAVs بنقل الخلايا العصبية بفعالية عالية وعلى المدى الطويل في دماغ الثدييات البالغ. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن التسليم المجسمة ل AAV-hαSyn في SN يعيد إنتاج العديد من الجوانب الأساسية للمرض ، بما في ذلك علم أمراض αSyn ، والتنشيط الدبقي الصغير ، والتنكس العصبي ، والإعاقة الحركية16،17،18،19،20. تقدم هذه الدراسة تحليلا لكيفية تأثير جرعة الناقل الفيروسي والوقت الذي يلي توصيل الناقل الفيروسي على مدى تعبير hαSyn ، والتنكس العصبي ، والالتهاب العصبي في المسار nigrostriatal ، وكذلك درجة الضعف الحركي في نموذج الماوس للتوصيل المجسمة أحادية الجانب ل hαSyn في SN.
Protocol
Representative Results
Discussion
قد يساعد نموذج الفأر للتنكس العصبي الذي تم تحليله هنا في دراسة العديد من الجوانب الحرجة المشاركة في الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون ، بما في ذلك الآليات المشاركة في علم أمراض αSyn والتنشيط الدبقي الصغير ، ومشاركة الجهاز المناعي المحيطي في تنظيم الالتهاب العصبي ، وآليات التنكس العصبي. من بين الآليات المشاركة في علم أمراض αSyn هي تلك الآليات دون الخلوية المرتبطة بخلل الميتوكوندريا أو الليزوسومات أو البروتيسومال في وجود حمل مفرط من αSyn في الخلايا العصبية الدوبامين في SN2. من المهم مراعاة أنه بالإضافة إلى تعبير hαSyn الناجم عن النقل بوساطة AAV ، يساهم الماوس الداخلي αSyn أيضا في حمل التعبير الكلي αSyn. الفئران المعدلة وراثيا التي تبالغ في التعبير عن الفئران αSyn تطور أمراض سينوكلين مماثلة ، وعلم الأمراض العصبية ، وضعف حركي لتلك النماذج الفئران على أساس الإفراط في التعبير عن hαSyn32. فيما يتعلق بالتنشيط الدبقي الصغير ، يمكن استخدام نموذج الفأر الحالي لدراسة كيف يمكن للاعبين الجزيئيين والخلويين المختلفين مثل السيتوكينات والناقلات العصبية والخلايا النجمية والخلايا العصبية والحاجز الدموي الدماغي والخلايا التائية تنظيم اكتساب الأنماط الظاهرية الوظيفية المؤيدة للالتهابات أو المضادة للالتهابات 8,10,11 . يشكل هذا النموذج أيضا أداة مهمة لدراسة دور الجهاز المناعي المحيطي ، بما في ذلك ليس فقط الخلايا التائية ولكن أيضا البلاعم والخلايا الوحيدة والعدلات ، على عمليات الالتهاب العصبي والتنكس العصبي للخلايا العصبية النيجيرية11،33،34. وأخيرا ، يمثل نموذج الفأر هذا أيضا نظاما قيما لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للتنكس العصبي في الجسم الحي ، بما في ذلك تلك التي تسببها العمليات الخلوية الداخلية ، مثل الإجهاد التأكسدي ، وعجز الطاقة ، والعضيات التالفة 2 ، أو تلك التي يمارسها اللاعبون الخارجيون ، مثل العوامل السمية العصبية التي تنتجها الخلايا الدبقية الدقيقة ، والخلايا النجمية ، والخلايا التائية السامة للخلايا8 ، 28,29,35.
أحد قيود نموذج الفأر هذا هو دراسة كيف أن التجميع المرضي ل αSyn في مواقع خارج الدماغ قد يشكل المراحل الأولية في تطور مرض باركنسون36. في هذا الصدد ، هناك أدلة متزايدة تشير إلى أنه قبل التنكس العصبي للخلايا العصبية النيجيرية والضعف الحركي ، يبدأ علم أمراض αSyn في الغشاء المخاطي للأمعاء والظهارة الشمية36 ، وربما استجابة الخلايا التائية الخاصة ب αSyn وكذلك12. بعد ذلك ، ستنتقل مجاميع αSyn عبر العصب المبهم إلى جذع الدماغ ، مما يؤدي إلى التهاب الأعصاب والتنكس العصبي للخلايا العصبية الدوبامينية12. على الرغم من أن نموذج AAV-hαSyn يلخص معظم جوانب مرض باركنسون ، إلا أنه لا توجد مشاركة واضحة للتجميع المرضي ل αSyn في مواقع خارج الدماغ في هذا النموذج. قد يكون النموذج البديل الذي يتضمن علم أمراض hαSyn مناسبا لدراسة هذه الجوانب من مرض باركنسون هو الفئران المعدلة وراثيا التي تبالغ في التعبير عن hαSyn تحت سيطرة مروج Thy1 ، نموذج Thy1-SNCA 37 ، حيث يعتمد تطور المرض على ميكروبات الأمعاء وينطوي على ضعف واضح في الجهاز الهضمي38.
على الرغم من أنه مفيد لدراسة العمليات المتنوعة المرتبطة بالفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون ، إلا أن نموذج الفأر الحالي ينطوي على خطوات حاسمة يجب فحصها بدقة ، بما في ذلك التسليم الصحيح للناقلات الفيروسية في الإحداثيات المكانية المقابلة ، والتعبير الانتقائي عن hαSyn في الخلايا العصبية (التي تعتمد على النمط المصلي AAV وبناء المتجه) ، وجرعة AAV المناسبة وتوقيتها قبل تحليل النمط الظاهري لمرض باركنسون. من الضروري تحليل التوصيل السليم للناقلات الفيروسية في SN ، لأن استخدام الإحداثيات المكانية الصحيحة ل SN قد لا يكون كافيا عندما لا تكون الإبرة مستقيمة تماما ، والتي تكون في بعض الأحيان غير محسوسة للعين البشرية. علاوة على ذلك ، يعتمد انتشار ناقلات AAV على النمط المصلي AAV39. ولهذه الأسباب، من الضروري إجراء ضوابط دورية للجودة للتحقق من التسليم والانتشار الصحيحين لناقلات AAV-GFP المحقونة بعد ملاحظة GFP في شرائح الدماغ التي تحتوي على منطقة SN.
فيما يتعلق بالتعبير الانتقائي ل hαSyn في الخلايا العصبية ، من حيث المبدأ ، يمكن هندسة التعبير عن hαSyn ليتم التحكم فيه من قبل مروج انتقائي للخلايا العصبية أو ، بشكل أكثر دقة ، انتقائي للخلايا العصبية الدوبامينية ، مثل استخدام مروج TH في ناقلات AAV للحث على التعبير الانتقائي للجينات في الخلايا العصبية الدوبامينية40 . ومع ذلك ، فإن هذه الاستراتيجية لا تعمل عندما يكون ما يتم البحث عنه هو التعبير المفرط عن جين الاهتمام. لهذا السبب ، في النموذج الحالي ، من الضروري استخدام مروج قوي (مروج يحفز تعبيرا عاليا عن الجين النهائي) والأنماط المصلية AAV مع الاستوائية العصبية. في هذه الدراسة ، تم استخدام مروج CBA كمروج قوي للحث على الإفراط في التعبير عن hαSyn ، وتم استخدام النمط المصلي AAV5 للناقل الفيروسي. تم استخدام هذا النمط المصلي من قبل لنقل الخلايا العصبية للفئران والفئران41,42. هنا ، أظهرت النتائج أنه بعد 12 أسبوعا من تسليم AAV5-GFP في SN من الفئران ، كان التألق الأخضر موجودا بشكل انتقائي على الجانب الجانبي لكل من SN والمخطط (الشكل 1) ، مما يشير إلى النقل الفعال للخلايا العصبية في المسار nigrostriatal.
جانب آخر حاسم من نموذج الفأر هذا لمرض باركنسون هو النقطة الزمنية المطلوبة لتحليل عملية معينة بعد الجراحة. في هذا الصدد ، يظهر هذا العمل دراسة حركية للعمليات المختلفة التي ينطوي عليها علم الأمراض. نظرا لأن النقاط الزمنية الرئيسية تتغير مع جرعة الجينوم الفيروسي المعطاة لكل فأر ، فإن النمط المصلي ل AAV المستخدم ، أو حتى مع دفعة AAV المستخدمة ، تم إجراء تحليل استجابة الجرعة لكمية AAV-αSyn المطلوبة للحث على فقدان كبير في الخلايا العصبية TH+ والإعاقة الحركية لأول مرة. وقد أظهرت الدراسات السابقة ضعفا حركيا كبيرا وفقدان الخلايا العصبية TH+ في المسار nigrostriatal بعد 12 أسبوعا من حقن AAV-αSyn في الفئران بجرعات تتراوح بين 6 × 108-3 × 10 10 الجينوم الفيروسي لكل فأر 16,17,30,31. وفقا لذلك ، تراوحت جرعة AAV-hαSyn المستخدمة للحث على تعبير hαSyn في المسار nigrostriatal ، وفقدان الخلايا العصبية TH + ، والضعف الحركي في الفئران من 1 × 108-1 × 1010 الجينوم الفيروسي لكل فأر. علاوة على ذلك ، للسيطرة على أن فقدان الخلايا العصبية TH + والضعف الحركي قد تم إجراؤه بسبب الإفراط في التعبير عن hαSyn في SN وليس عن طريق عدوى AAV للخلايا العصبية في SN ، تم تضمين مجموعات التحكم التي تم فيها تسليم ترميز AAV لجين مراسل (AAV-eGFP) من جانب واحد في SN من الفئران وتم تحديد التنكس العصبي والإعاقة الحركية. أظهرت النتائج أنه بعد 12 أسبوعا من الجراحة المجسمة ، كان 1 ×10 10 جينومات فيروسية لكل فأر جرعة مناسبة من AAV5-hαSyn ، حيث أظهرت الفئران التي تتلقى هذا الحمل الفيروسي hαSyn كبيرا في المسار nigrostriatal (الشكل 2 والشكل 3) ، وفقدان الخلايا العصبية TH+ (الشكل 4) ، وضعف الحركة (الشكل 5). وعلى النقيض من ذلك، لم تكن الجرعات المنخفضة من AAV5-hαSyn (1 × 108 جينومات فيروسية لكل فأر و 1 × 109 جينومات فيروسية لكل ماوس) قوية بما يكفي للوصول إلى تغييرات كبيرة في جميع هذه المعلمات معا (الأشكال 2-4). تجدر الإشارة إلى أن إعطاء AAV-GFP عند 1 × 10 10 جينوم فيروسي لكل فأر أدى إلى انخفاض (~20٪) ، ولكن درجة كبيرة من فقدان الخلايا العصبية TH+ من الخلايا العصبية الدوبامينية النيجيرية (الشكل 4A ، B). تتفق هذه النتيجة مع الملاحظات السابقة باستخدام هذا النموذج41 وربما تكون نتيجة لانخفاض مستوى الالتهاب العصبي الناجم عن إعطاء ناقلات AAV في SN. ومع ذلك ، كان مدى فقدان الخلايا العصبية TH+ أعلى بكثير في الفئران التي تتلقى AAV5-hαSyn مقارنة بتلك التي تتلقى نفس الجرعة من AAV-GFP (الشكل 4C). تجدر الإشارة إلى أن حركية تعبير hαSyn لا تعتمد فقط على كفاءة النقل ولكن أيضا على مدى انتشار AAV39. نظرا لأن انتشار AAV يعتمد على النمط المصلي AAV ، فقد تختلف النقاط الزمنية الرئيسية الدقيقة في هذا النموذج الحيواني عند استخدام نمط مصلي AAV آخر مختلف عن AAV5.
بعد ذلك ، تم إجراء تحليل حركي باستخدام 1 × 1010 جينوم فيروسي لكل فأر لتحديد النقاط الزمنية الرئيسية في نموذج الماوس هذا. نظرا لأن الأدلة الحالية أظهرت بعض الأعراض المبكرة التي تظهر قبل الإعاقة الحركية ، والتي من شأنها أن تسمح بالتشخيص المبكر لمرض باركنسون43,44 ، سعت هذه التجارب إلى العثور على النقطة الزمنية التي كان فيها تعبير hαSyn واضحا بالفعل ولكن في غياب ضعف حركي. تظهر النتائج أن بداية تعبير hαSyn في SN كانت في 5 أسابيع بعد التسليم المجسمة ل AAV-hαSyn (الشكل 6). تشكل هذه النقطة الزمنية نقطة زمنية مثيرة للاهتمام لبدء إدارة العلاجات المصممة خصيصا لوقف العمليات العصبية الالتهابية والتنكسية العصبية. كانت النقاط الزمنية الرئيسية الأخرى المحددة هنا هي أوقات الذروة لحدثين حاسمين مرتبطين بعملية الالتهاب العصبي: الوقت الذي تصل فيه الخلايا الدبقية الصغيرة إلى أقصى درجة من التنشيط ووقت أقصى تسرب للخلايا التائية إلى SN. أظهرت النتائج منحنى مع اتجاه يصل إلى موجتين من التنشيط الدبقي الصغير الأقصى ، الأولى في 10 أسابيع بعد الجراحة والثانية في 15 أسبوعا بعد الجراحة (الشكل 7). أظهر التحليل الحركي لتسلل الخلايا التائية وقت الذروة لتسلل Treg إلى SN في 11 أسبوعا بعد الجراحة المجسمة (الشكل 8). والمثير للدهشة أنه لم يتم الكشف عن أي خلايا T مستجيبة (CD4 + Foxp3-) تتسلل إلى SN خلال الإطار الزمني الذي تم تحليله (الأسابيع 8-13 بعد الجراحة). إجمالا، تشير هذه النتائج إلى إطار زمني مناسب للبدء في إدارة العلاجات الموجهة نحو وقف عملية التهاب الأعصاب وتخفيف تسلل الخلايا التائية إلى SN باستخدام هذا النموذج قبل السريري، والذي يتراوح بين الأسبوع 5 بعد الجراحة (بداية الإفراط في التعبير عن hαsyn) والأسبوع 10 بعد الجراحة (الموجة الأولى من التهاب الأعصاب وتسلل الخلايا التائية) (الشكل 9).
الشكل 9: ملخص للنقاط الزمنية الرئيسية التي تم العثور عليها لهذا النموذج الحيواني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور سيباستيان فالينزويلا والدكتورة ميكايلا ريكا على مساعدتهما البيطرية القيمة في منشأتنا الحيوانية. تم دعم هذا العمل من قبل “Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID” Centro Ciencia & Vida ، FB210008 (إلى Fundación Ciencia & Vida) ، ومركز Geroscience لصحة الدماغ والتمثيل الغذائي ، FONDAP-15150012. تم تمويل هذا العمل أيضا من خلال المنح FONDECYT-1210013 (إلى R.P) و FONDECYT-1150766 (إلى F.C.) من “الوكالة الوطنية للبحوث والتنمية في تشيلي (ANID)” و MJFF-10332.01 (إلى R.P) و MJFF-17303 (إلى F.C.) من مؤسسة مايكل جي فوكس لأبحاث باركنسون.
Materials
| ANIMALS AND ANIMAL FOOD | |||
| Foxp3-GFP C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 023800 | |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Wild-type C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 000664 | |
| VIRAL VECTORS | |||
| AAV5-CBA-αSyn | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 10E13 vg/mL |
| AAV5-CBA-eGFP | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL |
| ANESTHETICS AND ANALGESICS | |||
| Isoflurane | Baxter | 218082 | 1% for stereotaxic surgery |
| Ketamine | Drag Pharma | CHE30 | 70 mg/Kg for stereotaxic surgery |
| Sevoflurane | Baxter | VE2L9117 | For before transcardial perfusion |
| Tramadol | Drag Pharma | DPH134 | 30 mg/Kg every 24 h |
| Xylazine | Centrovet | EHL40 | 9 mg/kg for stereotaxic surgery |
| EQUIPMENT | |||
| Beam test | Home made | N/A | horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2). |
| Cryostate | Leica | CM1520 | |
| Digital camera | Nikon | S2800 Coolpix | For recording the beam test performance |
| Microscope | Olympus | BX51 | Used for IHC analysis (section 4.4) |
| Microscope | Olympus | IX71 | Used for IF analysis (section 5.3) |
| Microscope | Leica | DMI8 | Used for IF analysis (section 5.7) |
| New Standard Stereotaxic, mouse | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51500 | stereotaxic frame for surgery |
| Peristaltic Pump | Masterflex | C-flex L/S16 | |
| Power supply unit | Olympus | U-RFL-T | Used for IF analysis (section 5.3) |
| Surgical suture | Sylkam®, B Braun | C0760171 | |
| Syringe 100 U | BD | 324918 | For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle |
| Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | HA-7641-01 | For viral vector innoculation |
| BUFFERS AND REAGENTS | |||
| Aviden, Peroxidase Conjugate | Merck, Darmstadt, Germany | 189728 | |
| Bovine Serum Albumin | Merck, Darmstadt, Germany | 9048-46-8 | |
| Cryotrotection buffer | Home made | N/A | 20% glycerine and 2% DMSO in PBS |
| DAPI | Abcam | ab228549 | |
| Diaminobenzidine | Merck, Darmstadt, Germany | D8001 | |
| Fluoromount -G T | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Gelatin | Merck, Darmstadt, Germany | 104078 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 5000121 | |
| Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 104005 | |
| PBS | Home made | N/A | 0.125 M, pH 7.4 |
| Peroxidase inactivating buffer | Home made | N/A | 0.03% H2O2 in methanol |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| Trizma Hydrochloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1185-53-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 822184 | |
| ANTIBODIES | |||
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 111065003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11010 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A21244 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11081 | |
| Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein | Abcam | ab138501 | |
| Rabbit monoclonal anti-Iba-1 | Abcam | EPR16588 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | |
| Rat monoclonal anti-CD4 | Biolegend | 100402 | |
| SOFTWARES | |||
| GraphPad | Prism | 6.0 | Fos stats analysis |
| ImageJ | National Institute of Health | N/A | For image analysis |
| LAS X | Leica | N/A | For image capture with Leica microscope |
| ProgRes Capture Pro | Jenoptik | N/A | For image capture with Olympus microscope |
| VLC media player | VideoLAN Organization | N/A | For analysis of behavioural tests |
References
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Lim, K. L., Zhang, C. W. Molecular events underlying Parkinson’s disease – An interwoven tapestry. Frontiers in Neurology. 4, 33 (2013).
- Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
- Mori, F., et al. Relationship among alpha-synuclein accumulation, dopamine synthesis, and neurodegeneration in Parkinson disease substantia nigra. The Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 65 (8), 808-815 (2006).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Vazquez-Velez, G. E., Zoghbi, H. Y. Parkinson’s disease genetics and pathophysiology. Annual Review of Neuroscience. 44, 87-108 (2021).
- Dehay, B., et al. Lysosomal impairment in Parkinson’s disease. Movement Disorders. 28 (6), 725-732 (2013).
- Gonzalez, H., Elgueta, D., Montoya, A., Pacheco, R. Neuroimmune regulation of microglial activity involved in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. Journal of Neuroimmunology. 274 (1-2), 1-13 (2014).
- Pacheco, R. T-cell based immunotherapies for Parkinson’s disease. Exploration of Neuroprotective Therapy. 1 (2), 72-85 (2021).
- Gonzalez, H., Contreras, F., Pacheco, R. Regulation of the neurodegenerative process associated to Parkinson’s disease by CD4+ T-cells. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 10 (4), 561-575 (2015).
- Gonzalez, H., Pacheco, R. T-cell-mediated regulation of neuroinflammation involved in neurodegenerative diseases. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 201 (2014).
- Campos-Acuna, J., Elgueta, D., Pacheco, R. T-cell-driven inflammation as a mediator of the gut-brain axis involved in Parkinson’s disease. Frontiers in Immunology. 10, 239 (2019).
- Blesa, J., Phani, S., Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Classic and new animal models of Parkinson’s disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 845618 (2012).
- Ulusoy, A., Decressac, M., Kirik, D., Bjorklund, A. Viral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein as a progressive model of Parkinson’s disease. Progress in Brain Research. 184, 89-111 (2010).
- Gomez-Benito, M., et al. Modeling Parkinson’s disease with the alpha-synuclein protein. Frontiers in Pharmacology. 11, 356 (2020).
- Song, L. K., et al. Targeted overexpression of alpha-synuclein by rAAV2/1 vectors induces progressive nigrostriatal degeneration and increases vulnerability to MPTP in mouse. PLoS One. 10 (6), 0131281 (2015).
- Theodore, S., Cao, S., McLean, P. J., Standaert, D. G. Targeted overexpression of human alpha-synuclein triggers microglial activation and an adaptive immune response in a mouse model of Parkinson disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 67 (12), 1149-1158 (2008).
- Sanchez-Guajardo, V., Annibali, A., Jensen, P. H., Romero-Ramos, M. alpha-Synuclein vaccination prevents the accumulation of parkinson disease-like pathologic inclusions in striatum in association with regulatory T cell recruitment in a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 72 (7), 624-645 (2013).
- Sanchez-Guajardo, V., Febbraro, F., Kirik, D., Romero-Ramos, M. Microglia acquire distinct activation profiles depending on the degree of alpha-synuclein neuropathology in a rAAV based model of Parkinson’s disease. PLoS One. 5 (1), 8784 (2010).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 8, 44 (2013).
- Cho, C., et al. Evaluating analgesic efficacy and administration route following craniotomy in mice using the grimace scale. Scientific Reports. 9 (1), 359 (2019).
- Flecknell, P. . Laboratory Animal Anaesthesia. 3rd Ed. , (2009).
- Bind, R. H., Minney, S. M., Rosenfeld, S., Hallock, R. M. The role of pheromonal responses in rodent behavior: Future directions for the development of laboratory protocols. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (2), 124-129 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Elgueta, D., et al. Dopamine receptor D3 expression is altered in CD4+ T-cells from Parkinson’s disease patients and its pharmacologic inhibition attenuates the motor impairment in a mouse model. Frontiers in Immunology. 10, 981 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Fernandez-Suarez, D., et al. The monoacylglycerol lipase inhibitor JZL184 is neuroprotective and alters glial cell phenotype in the chronic MPTP mouse model. Neurobiology of Aging. 35 (11), 2603-2616 (2014).
- Elgueta, D., et al. Pharmacologic antagonism of dopamine receptor D3 attenuates neurodegeneration and motor impairment in a mouse model of Parkinson’s disease. Neuropharmacology. 113, 110-123 (2017).
- Montoya, A., et al. Dopamine receptor D3 signalling in astrocytes promotes neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 258 (2019).
- Williams, G. P., et al. Targeting of the class II transactivator attenuates inflammation and neurodegeneration in an alpha-synuclein model of Parkinson’s disease. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 244 (2018).
- Benskey, M. J., et al. Silencing alpha synuclein in mature nigral neurons results in rapid neuroinflammation and subsequent toxicity. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 36 (2018).
- Rieker, C., et al. Neuropathology in mice expressing mouse alpha-synuclein. PLoS One. 6 (9), 24834 (2011).
- Harms, A. S., et al. alpha-Synuclein fibrils recruit peripheral immune cells in the rat brain prior to neurodegeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 85 (2017).
- Williams, G. P., et al. CD4 T cells mediate brain inflammation and neurodegeneration in a mouse model of Parkinson disease. Brain. 144 (7), 2047-2059 (2021).
- Matheoud, D., et al. Intestinal infection triggers Parkinson’s disease-like symptoms in Pink1(-/-) mice. Nature. 571 (7766), 565-569 (2019).
- Jan, A., Goncalves, N. P., Vaegter, C. B., Jensen, P. H., Ferreira, N. The prion-like spreading of alpha-synuclein in Parkinson’s disease: Update on models and hypotheses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 8338 (2021).
- Chesselet, M. F., et al. A progressive mouse model of Parkinson’s disease: The Thy1-aSyn ("Line 61") mice. Neurotherapeutics. 9 (2), 297-314 (2012).
- Sampson, T. R., et al. Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson’s disease. Cell. 167 (6), 1469-1480 (2016).
- Ciron, C., et al. Human alpha-iduronidase gene transfer mediated by adeno-associated virus types 1, 2, and 5 in the brain of nonhuman primates: Vector diffusion and biodistribution. Human Gene Therapy. 20 (4), 350-360 (2009).
- Ben-Shaanan, T. L., et al. Activation of the reward system boosts innate and adaptive immunity. Nature Medicine. 22 (8), 940-944 (2016).
- Albert, K., Voutilainen, M. H., Domanskyi, A., Airavaara, M. AAV vector-mediated gene delivery to substantia nigra dopamine neurons: Implications for gene therapy and disease models. Genes. 8 (2), 63 (2017).
- Bordia, T., Perez, X. A., Heiss, J., Zhang, D., Quik, M. Optogenetic activation of striatal cholinergic interneurons regulates L-dopa-induced dyskinesias. Neurobiology of Disease. 91, 47-58 (2016).
- Kim, A., et al. Upgraded methodology for the development of early diagnosis of Parkinson’s disease based on searching blood markers in patients and experimental models. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3437-3450 (2018).
- Lei, H., et al. Parkinson’s disease diagnosis via joint learning from multiple modalities and relations. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 23 (4), 1437-1449 (2018).
