यह काम पार्किंसंस रोग के इस प्रीक्लिनिकल मॉडल में न्यूरोइंफ्लेमेशन, न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि को प्रेरित करने के लिए आवश्यक वेक्टर खुराक और एक्सपोजर समय का विश्लेषण करता है। मानव α-synuclein एन्कोडिंग इन वैक्टरों को पार्किंसंस रोग से जुड़े synuclein विकृति recapitulate करने के लिए substantia nigra में वितरित कर रहे हैं।
पार्किंसंस रोग एक न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जिसमें निग्रोस्ट्रियाटल मार्ग के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की मृत्यु शामिल है और परिणामस्वरूप, स्वैच्छिक आंदोलनों के नियंत्रण का प्रगतिशील नुकसान। यह न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रिया मस्तिष्क में प्रोटीन समुच्चय के जमाव से शुरू होती है, जो मुख्य रूप से α-सिन्यूक्लिन का गठन करती है। कई अध्ययनों ने संकेत दिया है कि पार्किंसंस रोग से जुड़े न्यूरोडीजेनेरेशन को विकसित करने के लिए न्यूरोइंफ्लेमेशन की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, neuroinflammatory प्रक्रिया में microglial सक्रियण के साथ-साथ परिधीय टी कोशिकाओं की घुसपैठ शामिल है substantia nigra (एसएन)। यह काम पार्किंसंस रोग के एक माउस मॉडल का विश्लेषण करता है जो माइक्रोग्लियल सक्रियण, एसएन में टी-सेल घुसपैठ, निग्राल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि को दोहराता है। पार्किंसंस रोग का यह माउस मॉडल एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर के स्टीरियोटैक्सिक वितरण से प्रेरित होता है जो एसएन में मानव जंगली-प्रकार के α-सिन्यूक्लिन (एएवी-hαSyn) को एन्कोडिंग करता है। एसएन में वायरल वैक्टर के सही वितरण की पुष्टि नियंत्रण वैक्टर एन्कोडिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) का उपयोग करके की गई थी। इसके बाद, एसएन में प्रशासित एएवी-hαSyn की खुराक ने hαSyn अभिव्यक्ति की सीमा को कैसे प्रभावित किया, निग्राल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के नुकसान और मोटर हानि का मूल्यांकन किया गया। इसके अलावा, hαSyn अभिव्यक्ति, microglial सक्रियण, और टी सेल घुसपैठ की गतिशीलता रोग के विकास के समय के दौरान निर्धारित किया गया था। इस प्रकार, यह अध्ययन महत्वपूर्ण समय बिंदु प्रदान करता है जो पार्किंसंस रोग के इस प्रीक्लिनिकल मॉडल में सिन्यूक्लिन पैथोलॉजी और न्यूरोइंफ्लेमेशन को लक्षित करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
अल्जाइमर रोग के बाद, पार्किंसंस रोग दुनिया भर में दूसरा सबसे प्रचलित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग है। पार्किंसंस रोग में प्रभावित प्राथमिक न्यूरॉन्स निग्रोस्ट्रिएटल मार्ग के हैं, जो डोपामाइन का उत्पादन करते हैं और स्वैच्छिक आंदोलन को नियंत्रित करते हैं। नतीजतन, इस विकार से जुड़ा सबसे विशिष्ट लक्षण मोटर हानि है। इस विकृति में मस्तिष्क में प्रोटीन समुच्चय का जमाव भी शामिल है, जो मुख्य रूप से α-सिन्यूक्लिन (αSyn)1 से बना है, जो प्रीसिनेप्टिक टर्मिनलों से जुड़ा एक साइटोसोलिक प्रोटीन है। साक्ष्य से पता चला है कि αSyn के रोगजनक समावेशन की पीढ़ी misfolding या इस प्रोटीन2 के कुछ पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों द्वारा ट्रिगर किया जाता है।
विशेष रूप से, αSyn पैथोलॉजी और मानव पार्किंसंस रोग और पशु मॉडल 3,4 में nigrostriatal मार्ग के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के नुकसान के बीच एक घनिष्ठ संबंध स्थापित किया गया है। यह समझना कि αSyn समुच्चय कैसे उत्पन्न होते हैं और वे न्यूरोनल मृत्यु को कैसे प्रेरित करते हैं, क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। अध्ययनों के एक बढ़ते समूह से पता चला है कि, ऑक्सीडेटिव तनाव को बढ़ाकर, माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता αSyn समुच्चय2 की पीढ़ी के लिए प्रमुख कारणों में से एक है। दरअसल, पार्किंसंस रोग के जोखिम से जुड़े कई जीन माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन, आकृति विज्ञान और गतिशीलता 5,6 में शामिल प्रोटीन को एन्कोड करते हैं। इसके अलावा, लाइसोसोमल डिसफंक्शन, जिसके परिणामस्वरूप बेकार माइटोकॉन्ड्रिया और मिसफोल्डेड αSyn का संचय होता है, एक और प्रमुख घटना का गठन करता है जो αSyn समुच्चय7 की पीढ़ी को बढ़ावा देता है।
उभरते हुए सबूतों ने संकेत दिया है कि, एक बार मस्तिष्क में αSyn समुच्चय जमा होने के बाद, ये रोगजनक प्रोटीन माइक्रोग्लिया पर टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) को उत्तेजित करते हैं, इस प्रकार माइक्रोग्लियाल सक्रियण और सबस्टेंसिया निग्रा (एसएन) 8,9 में एक प्रारंभिक भड़काऊ वातावरण को ट्रिगर करते हैं। इसके अलावा, सबूत इंगित करता है कि αSyn समुच्चय पर कब्जा कर लिया जाता है और एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं द्वारा टी कोशिकाओं को प्रस्तुत किया जाता है, जो αSyn10,11 के लिए विशिष्ट अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है। ये αSyn-विशिष्ट टी कोशिकाएं बाद में मस्तिष्क में घुसपैठ करती हैं और सक्रिय माइक्रोग्लिया द्वारा पुन: निर्धारित की जाती हैं, इस प्रकार न्यूरोटॉक्सिक कारकों के स्राव को बढ़ावा देती हैं जो न्यूरोनल मृत्यु को जन्म देतीहैं 9,10। दिलचस्प बात यह है कि सबूतों की कई लाइनों ने सुझाव दिया है कि αSyn समुच्चय पहले आंत्र तंत्रिका तंत्र में उत्पन्न होते हैं और फिर वेगस तंत्रिका के माध्यम से मस्तिष्क स्टेम12 में ले जाया जाता है।
पार्किंसंस रोग के कई पशु मॉडल का उपयोग कई वर्षों से किया गया है, जिसमें न्यूरोटॉक्सिक पदार्थों के प्रशासन से प्रेरित लोग शामिल हैं (यानी, 6-hydroxydopamine, paraquat, rotenone, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) और आनुवंशिक स्थितियों (यानी, उत्परिवर्ती α-synuclein, उत्परिवर्ती ल्यूसीन-समृद्ध दोहराने वाले किनेज 2) के प्रशासन से प्रेरित हैं। . पार्किंसंस रोग के कुछ पहलुओं की नकल करने वाले न्यूरोटॉक्सिन-प्रेरित न्यूरोडीजेनेरेशन से जुड़े मॉडल के बावजूद, उनमें से कोई भी बीमारी के सभी आवश्यक पहलुओं को दोहराता है या प्रगतिशील नहीं है। दूसरी ओर, हालांकि आनुवांशिक माउस मॉडल में ल्यूसीन-समृद्ध दोहराने वाले किनेज 2 के उत्परिवर्ती संस्करणों की अभिव्यक्ति, α-सिन्यूक्लिन के उत्परिवर्ती संस्करण, या मानव जंगली-प्रकार के α-सिन्यूक्लिन के ओवरएक्सप्रेशन के परिणामस्वरूप मोटर हानि होती है और, कुछ मामलों में, सिन्यूक्लिनोपैथी का विकास भी होता है, वे निग्रॉल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के प्रमुख न्यूरोडीजेनेरेशन को पुन: पेश नहीं करते हैं, जो पार्किंसंस रोग13 का एक अनिवार्य पहलू है, १४ । न्यूरोडीजेनेरेशन के एक तीसरे प्रकार के पशु मॉडल ने पार्किंसंस रोग के अधिकांश आवश्यक पहलुओं को पूरा करने में कामयाबी हासिल की है, एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर (एएवी) के स्टीरियोटैक्सिक वितरण ने मानव α-सिन्यूक्लिन (एएवी-hαSyn) को एन्कोडिंग किया है। महत्वपूर्ण रूप से, एएवी उच्च प्रभावकारिता के साथ न्यूरॉन्स के ट्रांसडक्शन की अनुमति देते हैं और स्तनधारियों के वयस्क मस्तिष्क में लंबी अवधि में। इसके अलावा, एसएन में AAV-hαSyn के स्टीरियोटैक्सिक वितरण को रोग के कई आवश्यक पहलुओं को पुन: पेश करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें αSyn पैथोलॉजी, माइक्रोग्लियल सक्रियण, न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि 16,17,18,19,20 शामिल हैं। यह अध्ययन इस बात का विश्लेषण प्रस्तुत करता है कि वायरल वेक्टर की खुराक और वायरल वेक्टर डिलीवरी के बाद का समय nigrostriatal मार्ग में hαSyn अभिव्यक्ति, न्यूरोडीजेनेरेशन और न्यूरोइन्फ्लेमेशन की सीमा को कैसे प्रभावित करता है, साथ ही साथ एसएन में hαSyn के एकतरफा स्टीरियोटैक्सिक वितरण के माउस मॉडल में मोटर हानि की डिग्री।
यहां विश्लेषण किए गए न्यूरोडीजेनेरेशन के माउस मॉडल पार्किंसंस रोग के पैथोफिजियोलॉजी में शामिल कई महत्वपूर्ण पहलुओं का अध्ययन करने में मदद कर सकते हैं, जिसमें αSyn पैथोलॉजी और माइक्रोग्लियल सक्रियण में शामिल तंत्र, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के विनियमन में परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली की भागीदारी, और न्यूरोडीजेनेरेशन के तंत्र शामिल हैं। αSyn विकृति में शामिल तंत्रों में से वे उपकोशिकीय तंत्र हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल, लाइसोसोमल, या प्रोटीसोमल डिसफंक्शन से जुड़े हैं, जो एसएन2 के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में αSyn के अत्यधिक भार की उपस्थिति में हैं। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि, AAV-मध्यस्थता ट्रांसडक्शन द्वारा प्रेरित hαSyn अभिव्यक्ति के अलावा, अंतर्जात माउस αSyn भी कुल αSyn अभिव्यक्ति के भार में योगदान देता है। ट्रांसजेनिक चूहों को अधिक व्यक्त माउस αSyn hαSyn के overexpression के आधार पर उन माउस मॉडल के लिए इसी तरह synuclein विकृति, neuropathology, और मोटर हानि विकसित करतेहैं। माइक्रोग्लियल सक्रियण के बारे में, वर्तमान माउस मॉडल का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है कि साइटोकिन्स, न्यूरोट्रांसमीटर, एस्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स, रक्त-मस्तिष्क बाधा और टी कोशिकाओं जैसे विभिन्न आणविक और सेलुलर खिलाड़ी प्रो-इंफ्लेमेटरी या विरोधी भड़काऊ कार्यात्मक फेनोटाइप के अधिग्रहण को कैसे विनियमित कर सकते हैं 8,10,11 . यह मॉडल परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का भी गठन करता है, जिसमें न केवल टी कोशिकाएं बल्कि मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल भी शामिल हैं, जो न्यूरोइंफ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन की प्रक्रियाओं पर भी शामिल हैं निग्रॉल न्यूरॉन्स 11,33,34। अंत में, यह माउस मॉडल विवो में न्यूरोडीजेनेरेशन के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली का भी प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें आंतरिक सेलुलर प्रक्रियाओं से प्रेरित लोग शामिल हैं, जैसे कि ऑक्सीडेटिव तनाव, ऊर्जा घाटे, और क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल 2, या बाहरी खिलाड़ियों द्वारा लगाए गए, जैसे कि माइक्रोग्लियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित न्यूरोटॉक्सिक कारक8, 28,29,35.
इस माउस मॉडल की एक सीमा इस बात का अध्ययन है कि अतिरिक्त-सेरेब्रल स्थानों में αSyn का पैथोलॉजिकल एकत्रीकरण पार्किंसंस रोग36 के विकास में प्रारंभिक चरणों का गठन कैसे कर सकता है। इस संबंध में, बढ़ते सबूत हैं जो यह दर्शाते हैं कि, निग्राल न्यूरॉन्स और मोटर हानि के न्यूरोडीजेनेरेशन से पहले, αSyn पैथोलॉजी आंत म्यूकोसा और घ्राण उपकला36 में शुरू होती है और, शायद, αSyn-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रिया के साथ-साथ12। इसके बाद, αSyn समुच्चय वेगस तंत्रिका के माध्यम से मस्तिष्क स्टेम में स्थानांतरित हो जाएगा, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स12 के न्यूरोइंफ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन को ट्रिगर करेगा। यद्यपि AAV-hαSyn मॉडल पार्किंसंस रोग के अधिकांश पहलुओं को दोहराता है, इस मॉडल में अतिरिक्त-सेरेब्रल स्थानों में αSyn के पैथोलॉजिकल एकत्रीकरण की कोई स्पष्ट भागीदारी नहीं है। पार्किंसंस रोग के इन पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त hαSyn पैथोलॉजी को शामिल करने वाला एक वैकल्पिक मॉडल ट्रांसजेनिक चूहों को Thy1 प्रमोटर, Thy1-SNCA मॉडल37 के नियंत्रण में hαSyn को अतिरंजित कर सकता है, जिसमें रोग का विकास आंत माइक्रोबायोटा पर निर्भर है और इसमें एक स्पष्ट जठरांत्र संबंधी हानिशामिल है 38।
यद्यपि यह पार्किंसंस रोग के पैथोफिजियोलॉजी से जुड़ी विभिन्न प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए सहायक है, वर्तमान माउस मॉडल में महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं जिन्हें बारीकी से जांचा जाना चाहिए, जिसमें संबंधित स्थानिक निर्देशांक में वायरल वैक्टर का सही वितरण, न्यूरॉन्स में hαSyn की चयनात्मक अभिव्यक्ति (जो एएवी सीरोटाइप और वेक्टर निर्माण पर निर्भर करता है), शामिल है। और पार्किंसंसियन फेनोटाइप का विश्लेषण करने से पहले उचित एएवी खुराक और समय। एसएन में वायरल वैक्टर के उचित वितरण का विश्लेषण आवश्यक है, क्योंकि एसएन के सही स्थानिक निर्देशांक का उपयोग पर्याप्त नहीं हो सकता है जब सुई पूरी तरह से सीधी नहीं होती है, जो कभी-कभी मानव आंख के लिए अगोचर होती है। इसके अलावा, एएवी वैक्टर का प्रसार एएवी सेरोटाइप39 पर निर्भर करता है। इन कारणों से, एसएन के क्षेत्र वाले मस्तिष्क स्लाइस में जीएफपी के अवलोकन के बाद इंजेक्ट किए गए एएवी-जीएफपी वैक्टर के सही वितरण और प्रसार की जांच करने के लिए आवधिक गुणवत्ता नियंत्रण करना आवश्यक है।
न्यूरॉन्स में hαSyn की चयनात्मक अभिव्यक्ति के बारे में, सिद्धांत रूप में, hαSyn की अभिव्यक्ति को न्यूरॉन्स के लिए चयनात्मक प्रमोटर द्वारा नियंत्रित करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है या, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के लिए भी अधिक सटीक, चयनात्मक, जैसे कि एएवी वैक्टर में टीएच प्रमोटर का उपयोग डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स40 में जीन की चयनात्मक अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए . हालांकि, यह रणनीति तब काम नहीं करती है जब जो मांग की जाती है वह ब्याज के जीन का ओवरएक्सप्रेशन है। इस कारण से, वर्तमान मॉडल में, एक मजबूत प्रमोटर (डाउनस्ट्रीम जीन की उच्च अभिव्यक्ति को प्रेरित करने वाला एक प्रमोटर) और न्यूरोनल ट्रोपिज़्म के साथ एएवी सेरोटाइप का उपयोग करना आवश्यक है। इस अध्ययन में, CBA प्रमोटर का उपयोग hαSyn के overexpression को प्रेरित करने के लिए एक मजबूत प्रमोटर के रूप में किया गया था, और AAV5 serotype का उपयोग वायरल वेक्टर के लिए किया गया था। इस सीरोटाइप का उपयोग माउस और चूहे के न्यूरॉन्स41,42 को ट्रांसड्यूस करने के लिए पहले किया गया है। यहां, परिणामों ने प्रदर्शित किया कि, चूहों के एसएन में एएवी 5-जीएफपी के वितरण के 12 सप्ताह बाद, हरे रंग की प्रतिदीप्ति एसएन और स्ट्रिएटम (चित्रा 1) दोनों के ipsilateral पक्ष पर चुनिंदा रूप से मौजूद थी, जो निग्रोस्ट्रियाटल मार्ग के न्यूरॉन्स के कुशल ट्रांसडक्शन का संकेत देती है।
पार्किंसंस रोग के इस माउस मॉडल का एक और महत्वपूर्ण पहलू सर्जरी के बाद एक विशेष प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक समय बिंदु है। इस संबंध में, यह काम पैथोलॉजी में शामिल विभिन्न प्रक्रियाओं का एक गतिज अध्ययन दिखाता है। चूंकि प्रति माउस दिए गए वायरल जीनोम की खुराक के साथ मुख्य समय बिंदु बदलते हैं, इसलिए एएवी के सीरोटाइप का उपयोग किया जाता है, या यहां तक कि एएवी के बैच के साथ भी उपयोग किया जाता है, टीएच + न्यूरॉन्स और मोटर हानि के महत्वपूर्ण नुकसान को प्रेरित करने के लिए आवश्यक एएवी-αSyn की मात्रा का एक खुराक-प्रतिक्रिया विश्लेषण पहली बार किया गया था। पिछले अध्ययनों ने महत्वपूर्ण मोटर हानि और चूहों में एएवी-αSyn इंजेक्शन के 12 सप्ताह के बाद TH + न्यूरॉन्स के नुकसान को 6 x 108-3 x 1010 प्रति माउस 16,17,30,31 प्रति वायरल जीनोम से लेकर खुराक पर चूहों में दिखाया है। तदनुसार, AAV-hαSyn की खुराक nigrostriatal मार्ग में hαSyn अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया, TH + न्यूरॉन्स के नुकसान, और चूहों में मोटर हानि प्रति माउस 1 x 108-1 x 1010 वायरल जीनोम से लेकर। इसके अलावा, यह नियंत्रित करने के लिए कि टीएच + न्यूरॉन्स और मोटर हानि के नुकसान को एसएन में एचजेडसिन के ओवरएक्सप्रेशन द्वारा प्रेरित किया गया था और एसएन के न्यूरॉन्स के एएवी संक्रमण द्वारा नहीं, नियंत्रण समूहों को शामिल किया गया था जिसमें एक रिपोर्टर जीन (एएवी-ईजीएफपी) के लिए एएवी कोडिंग को चूहों के एसएन में एकतरफा वितरित किया गया था और न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि निर्धारित की गई थी। परिणामों से पता चला है कि, स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के 12 सप्ताह बाद, माउस प्रति 1 x10 10 वायरल जीनोम AAV5-hαSyn की एक उचित खुराक थी, क्योंकि इस वायरल लोड को प्राप्त करने वाले चूहों ने nigrostriatal Pathway (चित्रा 2 और चित्रा 3), TH + न्यूरॉन्स (चित्रा 4) का नुकसान, और मोटर हानि (चित्रा 5) में महत्वपूर्ण hαSyn प्रदर्शित किया। इसके विपरीत, AAV5-hαSyn की कम खुराक (माउस प्रति 1 x 108 वायरल जीनोम और प्रति माउस 1 x 109 वायरल जीनोम) इन सभी मापदंडों में महत्वपूर्ण परिवर्तनों तक पहुंचने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं थे (आंकड़े 2-4)। ध्यान दें, माउस प्रति 1 x10 10 वायरल जीनोम पर एएवी-जीएफपी के प्रशासन ने कम (~ 20%) को प्रेरित किया, लेकिन निग्राल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के टीएच + न्यूरॉन्स के नुकसान की महत्वपूर्ण डिग्री (चित्रा 4 ए, बी)। यह परिणाम इस मॉडल41 का उपयोग करके पिछले अवलोकनों से सहमत है और शायद एसएन में एएवी वैक्टर के प्रशासन से प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन के निम्न स्तर का परिणाम है। फिर भी, टीएच + न्यूरॉन्स के नुकसान की सीमा एएवी 5-एचएक्ससिन प्राप्त करने वाले चूहों में एएवी-जीएफपी (चित्रा 4 सी) की समान खुराक प्राप्त करने वालों की तुलना में काफी अधिक थी। ध्यान दें, hαSyn अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स न केवल transduction की दक्षता पर निर्भर करते हैं, बल्कि AAV प्रसार39 की सीमा पर भी निर्भर करते हैं। चूंकि एएवी प्रसार एएवी सेरोटाइप पर निर्भर करता है, इसलिए इस पशु मॉडल में सटीक कुंजी समय बिंदु एएवी 5 से अलग एक और एएवी सीरोटाइप का उपयोग करते समय भिन्न हो सकते हैं।
इसके बाद, इस माउस मॉडल में प्रमुख समय बिंदुओं को निर्धारित करने के लिए प्रति माउस 1 x10 10 वायरल जीनोम का उपयोग करके एक गतिज विश्लेषण किया गया था। चूंकि वर्तमान साक्ष्य ने कुछ शुरुआती लक्षण दिखाए हैं जो मोटर हानि से पहले दिखाई देते हैं, जो पार्किंसंस रोग43,44 के शुरुआती निदान की अनुमति देगा, इन प्रयोगों ने उस समय बिंदु को खोजने की मांग की जिस पर hαSyn अभिव्यक्ति पहले से ही स्पष्ट थी, लेकिन मोटर हानि की अनुपस्थिति में। परिणामों से पता चलता है कि एसएन में hαSyn अभिव्यक्ति की शुरुआत AAV-hαSyn (चित्रा 6) के स्टीरियोटैक्सिक वितरण के 5 सप्ताह बाद थी। यह समय बिंदु एक दिलचस्प अस्थायी बिंदु का गठन करने के लिए neuroinflammatory और neurodegenerative प्रक्रियाओं को रोकने के लिए सिलवाया उपचार प्रशासन शुरू करने के लिए. यहां निर्धारित अन्य महत्वपूर्ण समय बिंदु न्यूरोइन्फ्लेमेशन प्रक्रिया से जुड़ी दो महत्वपूर्ण घटनाओं के लिए चरम समय थे: वह समय जिस पर माइक्रोग्लिया सक्रियण की अधिकतम डिग्री तक पहुंचता है और एसएन में अधिकतम टी-सेल घुसपैठ का समय होता है। परिणामों ने अधिकतम माइक्रोग्लियल सक्रियण की दो तरंगों तक पहुंचने की प्रवृत्ति के साथ एक वक्र दिखाया, पहला सर्जरी के बाद 10 सप्ताह में और दूसरा सर्जरी के बाद 15 सप्ताह में (चित्रा 7)। टी-सेल घुसपैठ के गतिज विश्लेषण ने स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी (चित्रा 8) के 11 सप्ताह बाद एसएन में ट्रेग घुसपैठ के चरम समय को दिखाया। हैरानी की बात है, कोई भी प्रभावक टी कोशिकाओं (CD4 + Foxp3–) का विश्लेषण समय सीमा (सर्जरी के बाद सप्ताह 8-13) के दौरान एसएन में घुसपैठ करने का पता चला था। कुल मिलाकर, ये परिणाम इस प्रीक्लिनिकल मॉडल का उपयोग करके एसएन में न्यूरोइंफ्लेमेशन की प्रक्रिया को रोकने और टी-सेल घुसपैठ को क्षीण करने की दिशा में तैयार किए गए उपचारों को प्रशासित करना शुरू करने के लिए समय का एक उचित फ्रेम सुझाते हैं, जो सर्जरी के बाद सप्ताह 5 (hαSyn overexpression की शुरुआत) और सर्जरी के बाद सप्ताह 10 (न्यूरोइंफ्लेमेशन और टी-सेल घुसपैठ की पहली लहर) (चित्रा 9) के बीच होता है।
चित्र 9: इस पशु मॉडल के लिए पाए गए मुख्य समय बिंदुओं का सारांश। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
The authors have nothing to disclose.
हम हमारे पशु सुविधा में उनकी मूल्यवान पशु चिकित्सा सहायता के लिए डॉ Sebastián Valenzuela और डॉ Micaela Ricca धन्यवाद. इस काम को “Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID” Centro Ciencia & Vida, FB210008 (Fundación Ciencia & Vida के लिए), और मस्तिष्क स्वास्थ्य और चयापचय के लिए Geroscience केंद्र, FONDAP-15150012 द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को FONDECYT-1210013 (आरपी के लिए) और FONDECYT-1150766 (एफसी के लिए) अनुदान द्वारा भी वित्त पोषित किया गया था , “Agencia Nacional de Investigación y DeSarrollo de Chile (ANID)” और MJFF-10332.01 (R.P.) और MJFF-17303 (F.C.) से माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन के लिए माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन से।
ANIMALS AND ANIMAL FOOD | |||
Foxp3-GFP C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 023800 | |
Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
Wild-type C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 000664 | |
VIRAL VECTORS | |||
AAV5-CBA-αSyn | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 10E13 vg/mL |
AAV5-CBA-eGFP | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL |
ANESTHETICS AND ANALGESICS | |||
Isoflurane | Baxter | 218082 | 1% for stereotaxic surgery |
Ketamine | Drag Pharma | CHE30 | 70 mg/Kg for stereotaxic surgery |
Sevoflurane | Baxter | VE2L9117 | For before transcardial perfusion |
Tramadol | Drag Pharma | DPH134 | 30 mg/Kg every 24 h |
Xylazine | Centrovet | EHL40 | 9 mg/kg for stereotaxic surgery |
EQUIPMENT | |||
Beam test | Home made | N/A | horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2). |
Cryostate | Leica | CM1520 | |
Digital camera | Nikon | S2800 Coolpix | For recording the beam test performance |
Microscope | Olympus | BX51 | Used for IHC analysis (section 4.4) |
Microscope | Olympus | IX71 | Used for IF analysis (section 5.3) |
Microscope | Leica | DMI8 | Used for IF analysis (section 5.7) |
New Standard Stereotaxic, mouse | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51500 | stereotaxic frame for surgery |
Peristaltic Pump | Masterflex | C-flex L/S16 | |
Power supply unit | Olympus | U-RFL-T | Used for IF analysis (section 5.3) |
Surgical suture | Sylkam®, B Braun | C0760171 | |
Syringe 100 U | BD | 324918 | For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle |
Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | HA-7641-01 | For viral vector innoculation |
BUFFERS AND REAGENTS | |||
Aviden, Peroxidase Conjugate | Merck, Darmstadt, Germany | 189728 | |
Bovine Serum Albumin | Merck, Darmstadt, Germany | 9048-46-8 | |
Cryotrotection buffer | Home made | N/A | 20% glycerine and 2% DMSO in PBS |
DAPI | Abcam | ab228549 | |
Diaminobenzidine | Merck, Darmstadt, Germany | D8001 | |
Fluoromount -G T | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
Gelatin | Merck, Darmstadt, Germany | 104078 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 5000121 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 104005 | |
PBS | Home made | N/A | 0.125 M, pH 7.4 |
Peroxidase inactivating buffer | Home made | N/A | 0.03% H2O2 in methanol |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
Trizma Hydrochloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1185-53-1 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 822184 | |
ANTIBODIES | |||
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 111065003 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11010 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A21244 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11081 | |
Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein | Abcam | ab138501 | |
Rabbit monoclonal anti-Iba-1 | Abcam | EPR16588 | |
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | |
Rat monoclonal anti-CD4 | Biolegend | 100402 | |
SOFTWARES | |||
GraphPad | Prism | 6.0 | Fos stats analysis |
ImageJ | National Institute of Health | N/A | For image analysis |
LAS X | Leica | N/A | For image capture with Leica microscope |
ProgRes Capture Pro | Jenoptik | N/A | For image capture with Olympus microscope |
VLC media player | VideoLAN Organization | N/A | For analysis of behavioural tests |