qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes
Summary
Le présent travail décrit les étapes de production d’une qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de T. cruzi qui peut être préchargée sur la cuve de réaction et conservée au réfrigérateur pendant plusieurs mois.
Abstract
La PCR en temps réel (qPCR) est une technique remarquablement sensible et précise qui permet d’amplifier des quantités infimes de cibles d’acides nucléiques à partir d’une multitude d’échantillons. Il a été largement utilisé dans de nombreux domaines de recherche et a atteint une application industrielle dans des domaines tels que le diagnostic humain et la sélection de caractères dans les cultures d’organismes génétiquement modifiés (OGM). Cependant, la qPCR n’est pas une technique à l’épreuve des erreurs. Le mélange de tous les réactifs en un seul mélange maître distribué par la suite sur 96 puits d’une plaque qPCR ordinaire peut entraîner des erreurs de l’opérateur telles qu’un mélange incorrect des réactifs ou une distribution inexacte dans les puits. Ici, une technique appelée gélification est présentée, par laquelle la majeure partie de l’eau présente dans le mélange maître est remplacée par des réactifs qui forment un mélange sol-gel lorsqu’ils sont soumis à un vide. En conséquence, les réactifs qPCR sont efficacement conservés pendant quelques semaines à température ambiante ou quelques mois à 2-8 °C. Les détails de la préparation de chaque solution sont présentés ici avec l’aspect attendu d’une réaction gélifiée conçue pour détecter l’ADN satellite de T. cruzi (ADNsatellite). Une procédure similaire peut être appliquée pour détecter d’autres organismes. Le démarrage d’une qPCR gélifiée est aussi simple que de retirer la plaque du réfrigérateur, d’ajouter les échantillons à leurs puits respectifs et de commencer l’exécution, réduisant ainsi le temps de configuration d’une réaction sur plaque complète au temps nécessaire pour charger les échantillons. De plus, les réactions PCR gélifiées peuvent être produites et contrôlées pour la qualité par lots, ce qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs courantes de l’opérateur lors de l’exécution de réactions PCR de routine.
Introduction
La maladie de Chagas a été découverte au début du 20èmesiècle dans les régions rurales du Brésil, où la pauvreté était répandue 1,2. Même aujourd’hui, la maladie continue d’être liée aux déterminants sociaux et économiques de la santé dans les Amériques. La maladie de Chagas est biphasique, comprenant une phase aiguë et une phase chronique. Elle est causée par une infection par le parasite Trypanosoma cruzi, transmise par des insectes vecteurs, des transfusions sanguines par voie congénitale ou l’ingestion orale d’aliments contaminés 3,4.
Le diagnostic de la maladie de Chagas peut être effectué par l’observation des symptômes cliniques (en particulier le signe Romaña), la microscopie par frottis sanguin, la sérologie et les tests moléculaires tels que la PCR en temps réel (qPCR) ou l’amplification isotherme 4,5,6,7,8,9. Les symptômes cliniques et la microscopie par frottis sanguin sont utilisés dans les cas suspects d’infections aiguës, tandis que la recherche d’anticorps est utilisée comme outil de dépistage chez les patients asymptomatiques. En raison de sa sensibilité et de sa spécificité, il a été suggéré que la qPCR soit utilisée comme outil de surveillance pour les patients chroniques, pour les patients en phase aiguë subissant un traitement mesurant la charge parasitaire dans le sang et comme marqueur de substitution de l’échec thérapeutique 6,8,10,11,12 . Bien que plus sensibles et spécifiques que les tests actuellement disponibles, la qPCR est effectivement empêchée d’être connue comme outil de diagnostic dans les régions défavorisées du monde entier en raison de l’exigence de températures de congélation pour le transport et le stockage13,14,15.
Pour contourner cet obstacle, des techniques de conservation telles que la lyophilisation et la gélification ont été explorées16,17. Bien que la lyophilisation assure la conservation pendant des années, elle nécessite des réactifs spécialement fabriqués sans la présence de glycérol, qui est couramment utilisé pour la stabilisation / conservation des enzymes18. Bien qu’il ait été démontré que la gélification assure la conservation pendant des mois, elle permet l’utilisation de réactifs réguliers19. La solution de gélification comprend quatre composants, chacun ayant des rôles spécifiques dans le processus: les sucres tréhalose et mélézitose protègent les biomolécules pendant le processus de dessiccation en réduisant les molécules d’eau libre dans la solution, le glycogène produit une matrice protectrice plus large et l’acide aminé lysine est utilisé comme piégeur de radicaux libres pour inhiber les réactions oxydantes entre le carboxyle de la biomolécule, groupes amino et phosphate. Ces composants définissent un mélange sol-gel qui empêche la perte de la structure tertiaire ou quaternaire pendant le processus de dessiccation, aidant ainsi à maintenir l’activité des biomolécules lors de la réhydratation19. Une fois stabilisées à l’intérieur des tubes de réaction, les réactions peuvent être conservées pendant quelques mois à 2-8 °C ou quelques semaines à 21-23 °C au lieu des -20 °C normales. Cette approche a déjà été intégrée dans des tests conçus pour aider à diagnostiquer des maladies telles que la maladie de Chagas, le paludisme, la leishmaniose, la tuberculose et la cyclosporose13,14,15,20.
Le présent travail décrit toutes les étapes pour préparer les solutions requises pour la procédure de gélification, les pièges du processus et l’aspect final attendu d’une qPCR gélifiée prête à l’emploi à l’intérieur de bandes à huit tubes. Le même protocole peut être adapté pour les tubes simples ou les plaques à 96 puits. Enfin, la détection de l’ADN de T. cruzi sera présentée sous forme de contrôle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ces dernières années ont mis en évidence la nécessité de trouver des technologies plus sensibles et spécifiques pour aider à diagnostiquer les maladies tropicales et négligées. Bien qu’importants pour le contrôle épidémiologique, les tests parasitologiques (microscopie optique) et sérologiques ont des limites, en particulier en ce qui concerne la sensibilité et l’applicabilité au point de service. Les techniques d’amplification de l’ADN telles que la PCR, l’amplification isotherme et les variatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude à Aline Burda Farias pour l’assistance technique avec le four à vide, ainsi qu’à l’administration de l’Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brésil) pour avoir permis l’accès audit équipement. Ces travaux ont été partiellement financés par la subvention CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
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