Mångfacetterad masspektrometrisk undersökning av neuropeptider i Callinectes sapidus
Summary
Masspektrometrisk karakterisering av neuropeptider ger sekvens-, kvantifierings- och lokaliseringsinformation. Detta optimerade arbetsflöde är inte bara användbart för neuropeptidstudier, utan också andra endogena peptider. Protokollen som tillhandahålls här beskriver provberedning, MS-förvärv, MS-analys och databasgenerering av neuropeptider med LC-ESI-MS, MALDI-MS-spotting och MALDI-MS-avbildning.
Abstract
Neuropeptider är signalmolekyler som reglerar nästan alla fysiologiska och beteendemässiga processer, såsom utveckling, reproduktion, matintag och svar på yttre stressfaktorer. Ändå är de biokemiska mekanismerna och det fullständiga komplementet av neuropeptider och deras funktionella roller fortfarande dåligt förstådda. Karakterisering av dessa endogena peptider hindras av den enorma mångfalden inom denna klass av signalmolekyler. Dessutom är neuropeptider bioaktiva vid koncentrationer 100x – 1000x lägre än för neurotransmittorer och är benägna att enzymatisk nedbrytning efter synaptisk frisättning. Masspektrometri (MS) är ett mycket känsligt analysverktyg som kan identifiera, kvantifiera och lokalisera analyter utan omfattande a priori-kunskap . Det är väl lämpat för global profilering av neuropeptider och hjälper till att upptäcka nya peptider. På grund av den låga mängden och den höga kemiska mångfalden i denna klass av peptider har flera provberedningsmetoder, MS-förvärvsparametrar och dataanalysstrategier anpassats från proteomiktekniker för att möjliggöra optimal neuropeptidkarakterisering. Här beskrivs metoder för att isolera neuropeptider från komplexa biologiska vävnader för sekvenskarakterisering, kvantifiering och lokalisering med hjälp av vätskekromatografi (LC)-MS och matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI)-MS. Ett protokoll för att förbereda en neuropeptiddatabas från blå krabban, Callinectes sapidus, en organism utan omfattande genomisk information, ingår. Dessa arbetsflöden kan anpassas för att studera andra klasser av endogena peptider i olika arter med hjälp av en mängd olika instrument.
Introduction
Nervsystemet är komplext och kräver ett nätverk av neuroner för att överföra signaler genom en organism. Nervsystemet samordnar sensorisk information och biologiskt svar. De invecklade och invecklade interaktionerna som är involverade i signalöverföring kräver många olika signalmolekyler såsom neurotransmittorer, steroider och neuropeptider. Eftersom neuropeptider är de mest mångsidiga och potenta signalmolekylerna som spelar nyckelroller för att aktivera fysiologiska svar på stress och andra stimuli, är det av intresse att bestämma deras specifika roll i dessa fysiologiska processer. Neuropeptidfunktionen är relaterad till deras aminosyrastruktur, som bestämmer rörlighet, receptorinteraktion och affinitet1. Tekniker som histokemi, vilket är viktigt eftersom neuropeptider kan syntetiseras, lagras och släppas i olika regioner i vävnaden, och elektrofysiologi har använts för att undersöka neuropeptidstruktur och funktion 2,3,4, men dessa metoder begränsas av genomströmning och specificitet för att lösa den stora sekvensdiversiteten av neuropeptider.
Masspektrometri (MS) möjliggör analys av hög genomströmning av neuropeptidstruktur och överflöd. Detta kan utföras genom olika MS-tekniker, oftast vätskekromatografi-elektrosprayjonisering MS (LC-ESI-MS)5 och matrisassisterad laserdesorption/jonisering MS (MALDI-MS)6. Genom att använda massmätningar med hög noggrannhet och MS-fragmentering ger MS möjlighet att tilldela aminosyrasekvens och post-translationell modifiering (PTM) -status till neuropeptider från komplexa blandningar utan förkunskaper för att hjälpa till att fastställa deras funktion 7,8. Förutom kvalitativ information möjliggör MS kvantitativ information om neuropeptider genom etikettfri kvantifiering (LFQ) eller etikettbaserade metoder såsom isotopisk eller isobar märkning9. De främsta fördelarna med LFQ inkluderar dess enkelhet, låga analyskostnader och minskade provberedningssteg som kan minimera provförlusten. Nackdelarna med LFQ inkluderar dock ökade instrumenttidskostnader eftersom det kräver flera tekniska replikat för att hantera kvantitativa fel från körning-till-kör-variabilitet. Detta leder också till en minskad förmåga att exakt kvantifiera små variationer. Etikettbaserade metoder utsätts för mindre systematisk variation eftersom flera prover kan märkas differentiellt med hjälp av en mängd stabila isotoper, kombineras till ett prov och analyseras genom masspektrometri samtidigt. Detta ökar också genomströmningen, även om isotopetiketter kan vara tidskrävande och kostsamma att syntetisera eller köpa. Full scan mass spectra (MS1) spektral komplexitet ökar också när multiplexering ökar, vilket minskar antalet unika neuropeptider som kan fragmenteras och därför identifieras. Omvänt ökar isobar märkning inte spektralkomplexiteten på MS1-nivå, även om den introducerar utmaningar för analyter med låg förekomst, såsom neuropeptider. Eftersom isobar kvantifiering utförs på fragmentjonmasspektranivå (MS2) kan neuropeptider med låg förekomst inte kvantifieras eftersom mer rikliga matriskomponenter kan väljas för fragmentering och de utvalda kanske inte har tillräckligt hög förekomst för att kvantifieras. Med isotopmärkning kan kvantifiering utföras på varje identifierad peptid.
Förutom identifiering och kvantifiering kan lokaliseringsinformation erhållas av MS genom MALDI-MS-avbildning (MALDI-MSI)10. Genom att rastrera en laser över en provyta kan MS-spektra sammanställas till en värmekartbild för varje m/z-värde . Kartläggning av övergående neuropeptidsignalintensitet i olika regioner över förhållanden kan ge värdefull information för funktionsbestämning11. Lokalisering av neuropeptider är särskilt viktigt eftersom neuropeptidfunktionen kan variera beroende på plats12.
Neuropeptider finns i lägre förekomst in vivo än andra signalmolekyler, såsom neurotransmittorer, och kräver därmed känsliga metoder för detektion13. Detta kan uppnås genom avlägsnande av matriskomponenter med högre överflöd, såsom lipider11,14. Ytterligare överväganden för analys av neuropeptider måste göras jämfört med vanliga proteomikarbetsflöden, främst för att de flesta neuropepidiomiska analyser utelämnar enzymatisk matsmältning. Detta begränsar programvarualternativen för neuropeptiddataanalys eftersom de flesta byggdes med algoritmer baserade på proteomikdata och proteinmatchningar informerade av peptiddetektering. Men många program som PEAKS15 är mer lämpade för neuropeptidanalys på grund av deras de novo-sekvenseringsfunktioner. Flera faktorer måste beaktas för analys av neuropeptider från extraktionsmetod till MS-dataanalys.
Protokollen som beskrivs här inkluderar metoder för provberedning och dimetylisotopmärkning, datainsamling och dataanalys av neuropeptider av LC-ESI-MS, MALDI-MS och MALDI-MSI. Genom representativa resultat från flera experiment demonstreras nyttan och förmågan hos dessa metoder att identifiera, kvantifiera och lokalisera neuropeptider från blå krabbor, Callinectes sapidus. För att bättre förstå nervsystemet används ofta modellsystem. Många organismer har inte ett helt sekvenserat genom tillgängligt, vilket förhindrar omfattande neuropeptidupptäckt på peptidnivå. För att mildra denna utmaning ingår ett protokoll för att identifiera nya neuropeptider och transkriptombrytning för att generera databaser för organismer utan fullständig genominformation. Alla protokoll som presenteras här kan optimeras för neuropeptidprover från vilken art som helst, samt tillämpas för analys av alla endogena peptider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den exakta identifieringen, kvantifieringen och lokaliseringen av neuropeptider och endogena peptider som finns i nervsystemet är avgörande för att förstå deras funktion23,24. Masspektrometri är en kraftfull teknik som kan göra det möjligt att åstadkomma allt detta, även i organismer utan ett helt sekvenserat genom. Förmågan hos detta protokoll att detektera, kvantifiera och lokalisera neuropeptider från vävnad som samlats in från C. sapidus</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av National Science Foundation (CHE-1710140 och CHE-2108223) och National Institutes of Health (NIH) genom bidrag R01DK071801. AP stöddes delvis av NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. stöddes delvis av National Institutes of Health, under Ruth L. Kirschstein National Research Service Award från National Heart Lung and Blood Institute till University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. vill erkänna NIH-bidrag R56 MH110215, S10RR029531 och S10OD025084, samt finansieringsstöd från en Vilas Distinguished Achievement Professorship och Charles Melbourne Johnson Professorship med finansiering från Wisconsin Alumni Research Foundation och University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides – an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
