Snabb inkapsling av rekonstituerad cytoskelett inuti jätte unilamellarblåsor

Summary

Denna artikel introducerar en enkel metod för snabb produktion av gigantiska unilamellarblåsor med inkapslade cytoskelettproteiner. Metoden visar sig vara användbar för bottom-up rekonstitution av cytoskelettstrukturer i inneslutning och cytoskelett-membraninteraktioner.

Abstract

Gigantiska unilamellarblåsor (GUV) används ofta som modeller av biologiska membran och är därför ett utmärkt verktyg för att studera membranrelaterade cellulära processer in vitro. Under de senaste åren har inkapsling inom GUVs visat sig vara ett användbart tillvägagångssätt för rekonstitueringsexperiment inom cellbiologi och relaterade områden. Det efterliknar bättre inneslutningsförhållanden inuti levande celler, i motsats till konventionell biokemisk rekonstituering. Metoder för inkapsling inuti GUVs är ofta inte lätta att implementera, och framgångsgraden kan skilja sig avsevärt från labb till labb. En teknik som har visat sig vara framgångsrik för att kapsla in mer komplexa proteinsystem kallas continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Här presenteras en cDICE-baserad metod för att snabbt kapsla in cytoskelettproteiner i GUV med hög inkapslingseffektivitet. I denna metod genereras först lipid-monolagerdroppar genom att emulgera en proteinlösning av intresse i en lipid / oljeblandning. Efter att ha tillsatts i en roterande 3D-tryckt kammare passerar dessa lipid-monolagerade droppar sedan genom ett andra lipidmonolager vid ett vatten / oljegränssnitt inuti kammaren för att bilda GUVs som innehåller proteinsystemet. Denna metod förenklar det övergripande förfarandet för inkapsling inom GUV och påskyndar processen, och gör det därmed möjligt för oss att begränsa och observera den dynamiska utvecklingen av nätverksmontering inuti lipid-dubbelskiktsblåsor. Denna plattform är praktisk för att studera mekaniken för cytoskelett-membraninteraktioner i inneslutning.

Introduction

Lipid-dubbelskiktsfack används som modellsyntetiska celler för att studera slutna organiska reaktioner och membranbaserade processer eller som bärarmoduler i läkemedelsleveransapplikationer ^1,2. Bottom-up biologi med renade komponenter kräver minimala experimentella system för att utforska egenskaper och interaktioner mellan biomolekyler, såsom proteiner och lipider ^3,4. Men med fältets framsteg finns det ett ökat behov av mer komplexa experimentella system som bättre imiterar förhållandena i biologiska celler. Inkapsling i GUVs är ett praktiskt tillvägagångssätt som kan erbjuda några av dessa cellliknande egenskaper genom att tillhandahålla ett deformerbart och selektivt permeabelt lipid-dubbelskikt och ett begränsat reaktionsutrymme. I synnerhet kan in vitro-rekonstituering av cytoskelettsystem, som modeller av syntetiska celler, dra nytta av inkapsling i membranfack⁵. Många cytoskelettproteiner binder och interagerar med cellmembranet. Eftersom de flesta cytoskelettaggregat bildar strukturer som sträcker sig över hela cellen, bestäms deras form naturligt av cellstorlek⁶.

Olika metoder används för att generera GUV, såsom svullnad ^7,8, liten vesikelfusion ^9,10, emulsionsöverföring^11,12, pulserad sprutning¹³ och andra mikrofluidiska tillvägagångssätt^14,15. Även om dessa metoder fortfarande används, har var och en sina begränsningar. Således är ett robust och enkelt tillvägagångssätt med ett högt utbyte av GUV-inkapsling mycket önskvärt. Även om tekniker som spontan svullnad och elektroswelling används allmänt för bildandet av GUV, är dessa metoder främst kompatibla med specifika lipidkompositioner¹⁶, låg saltkoncentrationsbuffertar¹⁷, mindre inkapslingsmolekylstorlek¹⁸ och kräver en hög volym av inkapslingsmedlet. Att smälta samman flera små vesiklar till en GUV är i sig energiskt ogynnsamt, vilket kräver specificitet i laddade lipidkompositioner⁹ och / eller externa fusionsinducerande medel, såsom peptider¹⁹ eller andra kemikalier. Emulsionsöverföring och mikrofluidiska metoder kan å andra sidan kräva droppstabilisering genom avlägsnande av ytaktivt medel och lösningsmedel efter tvåskiktsbildning, respektive^18,20. Komplexiteten i experimentell installation och anordning i mikrofluidiska tekniker som pulserad jetting innebär en ytterligare utmaning²¹. cDICE är en emulsionsbaserad metod härledd från liknande principer för emulsionsöverföring^22,23. En vattenlösning (yttre lösning) och en lipid-oljeblandning stratifieras av centrifugalkrafter i en roterande cylindrisk kammare (cDICE-kammare) som bildar ett lipidmättat gränssnitt. Shuttling lipid monolayered vattenhaltiga droppar i den roterande cDICE-kammaren resulterar i zipping av ett dubbelskikt när droppar korsar det lipidmättade gränssnittet i den yttre vattenhaltiga lösningen^22,24. cDICE-metoden är en robust teknik för GUV-inkapsling. Med den presenterade modifierade metoden uppnås inte bara det höga vesikelutbytet som är typiskt för cDICE med en signifikant kortare inkapslingstid (några sekunder) utan GUV-genereringstid som möjliggör observation av tidsberoende processer (t.ex. aktin cytoskelettnätverksbildning) reduceras avsevärt. Protokollet tar ca 15-20 min från start till GUV insamling och avbildning. Här beskrivs GUV-generering med hjälp av den modifierade cDICE-metoden för inkapsling av aktin och aktinbindande proteiner (ABPs). Den presenterade tekniken är emellertid tillämplig för att kapsla in ett brett spektrum av biologiska reaktioner och membraninteraktioner, från sammansättning av biopolymerer till cellfritt proteinuttryck till membranfusionsbaserad lastöverföring.

Protocol

1. Beredning av olja-lipid-blandning OBS: Steget måste utföras i en dragskåp enligt alla säkerhetsriktlinjer för hantering av kloroform. Ta 0,5 ml kloroform i en 15 ml glasflaska. Tillsätt 88 μl 25 mg/ml dioleoylfosfokolin (DOPC), 9,3 μl 50 mg/ml kolesterol och 5 μl 1 mg/ml dioleoylfosfoetanolamin-lissamin rhodamin B (rhodamin PE) (se materialtabell) i injektionsflaskan med 15 ml glas.OBS: De slutliga molfraktionerna av DOPC och kolester…

Representative Results

För att demonstrera den framgångsrika genereringen av cytoskelett-GUV med hjälp av det nuvarande protokollet rekonstituerades fascin-aktinbuntstrukturer i GUV. Fascin är en kort tvärbindare av aktinfilament som bildar styva parallelljusterade aktinbuntar och renas från E. coli som glutation-S-transferas (GST) fusionsprotein26. 5 μM aktin rekonstituerades först, inklusive 0,53 μM ATTO488-aktin i aktinpolymerisationsbufferten och 7,5% av densitetsgradientmediet. Vid tillsats av fas…

Discussion

Olika metoder för att generera GUV har undersökts för skapandet av syntetiska celler Men komplexiteten i procedurerna, förlängd tid för att uppnå inkapsling, begränsning av lipidtyper och molekylär sammansättning av inkapslingsmedlet, behovet av icke-fysiologiska kemikalier för att underlätta inkapsling, lågt GUV-utbyte och inkonsekvenser i inkapslingseffektivitet har fortsatt att utmana forskare inom detta område. Med tanke på det breda utbudet av potentiella studier som kan inledas inom syntetisk biologi…

Materials

18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667