Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays
Summary
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.
Abstract
Het grootste deel van de energie van de cel wordt verkregen door de afbraak van glucose, vetzuren en aminozuren door verschillende routes die samenkomen op het mitochondriale oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS), dat wordt gereguleerd als reactie op cellulaire eisen. Het lipidemolecuul Co-enzym Q (CoQ) is essentieel in dit proces door elektronen over te brengen naar complex III in de elektronentransportketen (ETC) door constante oxidatie/ reductiecycli. Mitochondriale status en, uiteindelijk, cellulaire gezondheid kunnen worden beoordeeld door etc zuurstofverbruik te meten met behulp van respirometrische assays. Deze studies worden meestal uitgevoerd in gevestigde of primaire cellijnen die gedurende meerdere dagen zijn gekweekt. In beide gevallen kunnen de verkregen ademhalingsparameters afwijken van de normale fysiologische omstandigheden in een bepaald orgaan of weefsel.
Bovendien belemmeren de intrinsieke kenmerken van gekweekte enkelvoudige vezels geïsoleerd uit skeletspieren dit type analyse. Dit artikel presenteert een bijgewerkt en gedetailleerd protocol voor de analyse van ademhaling in vers geïsoleerde mitochondriën van muizenskeletspieren. We bieden ook oplossingen voor mogelijke problemen die zich in elke stap van het proces kunnen voordoen. De hier gepresenteerde methode kan worden toegepast om zuurstofverbruikssnelheden in verschillende transgene muismodellen te vergelijken en de mitochondriale respons op medicamenteuze behandelingen of andere factoren zoals veroudering of geslacht te bestuderen. Dit is een haalbare methode om te reageren op cruciale vragen over mitochondriaal bio-energetisch metabolisme en regulatie.
Introduction
Mitochondriën zijn de primaire metabole organellen in de cel1. Deze gespecialiseerde membraan-ingesloten organellen gebruiken voedingsmoleculen om energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP) door OXPHOS. Dit proces is afhankelijk van de overdracht van elektronen van donormoleculen in een reeks redoxreacties in de ETC2. CoQ is het enige redox-actieve lipide dat endogeen wordt geproduceerd in alle celmembranen en circulerende lipoproteïnen die een antioxiderende functie vertoont3. Het is een essentieel onderdeel van de ETC, het overbrengen van elektronen van NADH-afhankelijk complex I en FADH2-afhankelijk complex II naar complex III, hoewel veel andere reductasen de reductie van mitochondriale CoQ naar ubiquinol kunnen stimuleren als een verplichte stap in meerdere cellulaire metabole routes4,5.
Gedurende het hele proces wordt een elektrochemische protongradiënt gecreëerd over het mitochondriale binnenmembraan, dat wordt omgezet in biologisch actieve energie door het ATP-synthasecomplex V2. Bijgevolg leidt mitochondriale disfunctie tot een groot aantal pathologische aandoeningen die voornamelijk weefsels met hoge energiebehoeften beïnvloeden – de hersenen, het hart en de skeletspieren6,7. Daarom is het van fundamenteel belang om methoden te ontwikkelen om mitochondriale bio-energetica nauwkeurig te analyseren om de rol ervan in gezondheid en ziekte te onderzoeken, met name in hoogenergetische weefsels zoals skeletspieren.
De Clark-type zuurstofelektrode is klassiek gebruikt in de studie van mitochondriale ademhaling8. Dit systeem is echter geleidelijk verdrongen door technologieën met een hogere resolutie, waarbij op microplaten gebaseerde zuurstofverbruikstechnologieën zoals Agilent Seahorse XF-analyzers bijzonder populair zijn9. Op het gebied van skeletspieren worden deze studies meestal uitgevoerd in gekweekte cellen, voornamelijk in de C2C12 vereeuwigde muismyoblastcellijn of primaire culturen afgeleid van satellietcellen10,11. Deze studies vatten de situatie echter niet volledig in vivo samen, vooral bij het onderzoeken van mitochondriale biologie en functie op weefselniveau bij specifieke beledigingen, niet-genetische interventies of genetische manipulaties.
Bovendien zijn ademhalingstests in cellen complexer vanwege aanvullende factoren, waaronder extra mitochondriale vraag naar ATP en assaysubstraten of signaalgebeurtenissen, die de interpretatie van de resultaten kunnen misleiden. Als alternatief is het ook mogelijk om enkele of bundels vers geïsoleerde myofibers uit spieren te gebruiken. De isolatiemethode is echter technisch uitdagend en slechts voor enkele spiertypen haalbaar. In dit geval worden voornamelijk flexor digitorum brevis (FDB) en extensor digitorum longus (EDL) spieren gebruikt10,12,13, hoewel enkele rapporten ook het gebruik van andere spiertypen beschrijven14,15.
Bio-energetische profilering van skeletspiersecties is ook gemeld16. Het grote voordeel van deze methode is dat intacte spieren kunnen worden bestudeerd (de auteurs laten zien dat het snijden door vezels de resultaten niet verstoort in vergelijking met geïsoleerde myofiberen). De mitochondriale toegang tot substraten en assayremmers is echter beperkt en dus kunnen slechts enkele parameters worden gemeten16. Ten slotte kunnen geïsoleerde mitochondriën ook worden gebruikt9,17,18,19. In dit geval verliezen mitochondriën hun cytosolische omgeving, wat hun functie kan beïnvloeden. Deze methode garandeert daarentegen toegang tot substraten en remmers, maakt de analyse van een overvloed aan monstertypen mogelijk en vereist doorgaans minder materiaal.
Dit artikel beschrijft een methode om de bio-energetische profilering van geïsoleerde mitochondriën uit de skeletspieren van muizen uit te voeren met behulp van respirometrische assays op basis van microplaten (figuur 1). In het bijzonder zijn drie protocollen gedetailleerd: de koppelingstest, CA om de mate van koppeling tussen de ETC en de OXPHOS-machines te beoordelen; de Electron Flow Assay, EFA om de activiteit van de afzonderlijke ETC-complexen te meten; en de BOX-test om mitochondriale β-oxidatiecapaciteit te bepalen. Met name zijn slechts kleine hoeveelheden monsters vereist in vergelijking met conventionele respirometriemethoden. Het hier gebruikte isolatieprotocol is aangepast ten opzichte van de elders gepubliceerde methode18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle methoden die worden gebruikt om mitochondriale ademhaling te bestuderen, hebben hun beperkingen; daarom is het cruciaal om de methode te kiezen die het beste past bij een specifieke experimentele vraag. Dit werk biedt een bijgewerkt en gedetailleerd protocol om mitochondriën te isoleren van de skeletspieren van muizen om verschillende ademhalingstests uit te voeren om de mitochondriale functie te onderzoeken. Inderdaad, de studie van mitochondriale bio-energetica in geïsoleerde mitochondriën met behulp van microp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Juan J. Tena bedanken voor het gebruik van de homogenisator en de CABD Proteomics en Veeteelt faciliteiten voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van Onderwijs, Cultuur en Sport via fellowship FPU16/03264 aan J.D.H.C., de Association Française contre les Myopathies (AFM) via fellowship grant #22450 aan C.V.-G., een Institutional Grant MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis bij CABD) en BFU2017-83150-P aan J.J.C. De Junta de Andalucía-subsidie P18-RT-4572, het FEDER-financieringsprogramma van de Europese Unie en het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten verlenen RED2018-102576-T aan P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
