عزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر لإجراء فحوصات قياس التنفس
Summary
هنا ، نصف طريقة مفصلة لعزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر والتحليل اللاحق للتنفس بواسطة معدل استهلاك الأكسجين (OCR) باستخدام المقايسات التنفسية القائمة على الصفائح الدقيقة. يمكن تطبيق خط الأنابيب هذا لدراسة آثار التدخلات البيئية أو الجينية المتعددة على استقلاب الميتوكوندريا.
Abstract
يتم الحصول على معظم طاقة الخلية من خلال تحلل الجلوكوز والأحماض الدهنية والأحماض الأمينية من خلال مسارات مختلفة تتلاقى على نظام الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا (OXPHOS) ، والذي يتم تنظيمه استجابة للطلبات الخلوية. جزيء الدهون الإنزيم المساعد Q (CoQ) ضروري في هذه العملية عن طريق نقل الإلكترونات إلى المركب الثالث في سلسلة نقل الإلكترون (ETC) من خلال دورات أكسدة / اختزال ثابتة. يمكن تقييم حالة الميتوكوندريا ، وفي النهاية ، الصحة الخلوية عن طريق قياس استهلاك الأكسجين ETC باستخدام المقايسات التنفسية. عادة ما يتم إجراء هذه الدراسات في خطوط الخلايا الثابتة أو الأولية التي تم زراعتها لعدة أيام. في كلتا الحالتين ، قد تكون معلمات التنفس التي تم الحصول عليها قد انحرفت عن الظروف الفسيولوجية الطبيعية في أي عضو أو نسيج معين.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخصائص الجوهرية للألياف المفردة المستزرعة المعزولة من العضلات الهيكلية تعيق هذا النوع من التحليل. تقدم هذه الورقة بروتوكولا محدثا ومفصلا لتحليل التنفس في الميتوكوندريا المعزولة حديثا من العضلات الهيكلية للفأر. كما نقدم حلولا للمشاكل المحتملة التي يمكن أن تنشأ في أي خطوة من خطوات العملية. يمكن تطبيق الطريقة المعروضة هنا لمقارنة معدلات استهلاك الأكسجين في نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتنوعة ودراسة استجابة الميتوكوندريا للعلاجات الدوائية أو عوامل أخرى مثل الشيخوخة أو الجنس. هذه طريقة مجدية للرد على الأسئلة الحاسمة حول استقلاب وتنظيم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية الأساسية في الخلية1. تستخدم هذه العضيات المتخصصة المغلقة بالأغشية جزيئات مغذية لإنتاج الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) بواسطة OXPHOS. تعتمد هذه العملية على نقل الإلكترونات من الجزيئات المانحة في سلسلة من تفاعلات الأكسدة والاختزال في ETC2. CoQ هو الدهون الوحيدة النشطة في الأكسدة والاختزال التي يتم إنتاجها داخليا في جميع الأغشية الخلوية والبروتينات الدهنية المتداولة التي تظهر وظيفة مضادات الأكسدة 3. وهو مكون أساسي في ETC ، حيث ينقل الإلكترونات من المجمع I المعتمد على NADH والمجمع الثاني المعتمد على FADH2 إلى المركب الثالث ، على الرغم من أن العديد من المختزلات الأخرى يمكن أن تدفع إلى تقليل CoQ الميتوكوندريا إلى يوبيكوينول كخطوة إلزامية في مسارات التمثيل الغذائي الخلوية المتعددة4,5.
طوال العملية ، يتم إنشاء تدرج بروتون كهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم تحويله إلى طاقة نشطة بيولوجيا بواسطة مركب ATP synthase V2. وبالتالي ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى عدد لا يحصى من الحالات المرضية التي تؤثر بشكل رئيسي على الأنسجة ذات المتطلبات العالية للطاقة – الدماغ والقلب والعضلات الهيكلية6,7. لذلك ، من الضروري تطوير طرق لتحليل الطاقة الحيوية للميتوكوندريا بدقة للتحقيق في دورها في الصحة والمرض ، خاصة في الأنسجة عالية الطاقة مثل العضلات الهيكلية.
تم استخدام قطب الأكسجين من نوع كلارك بشكل كلاسيكي في دراسة تنفس الميتوكوندريا8. ومع ذلك، فقد تم استبدال هذا النظام تدريجيا بتقنيات عالية الدقة، مع تقنيات استهلاك الأكسجين القائمة على الصفائح الدقيقة مثل أجهزة تحليل Agilent Seahorse XF التي تحظى بشعبية خاصة9. في مجال العضلات الهيكلية ، يتم إجراء هذه الدراسات عادة في الخلايا المستزرعة ، وخاصة في خط الخلايا العضلية المخلدة للفئران C2C12 أو الثقافات الأولية المشتقة من خلايا الأقمار الصناعية 10,11. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات لا تلخص بشكل كامل الوضع في الجسم الحي ، خاصة عند التحقيق في بيولوجيا الميتوكوندريا ووظيفتها على مستوى الأنسجة عند إهانات محددة أو تدخلات غير جينية أو تلاعبات جينية.
علاوة على ذلك ، فإن اختبارات التنفس في الخلايا أكثر تعقيدا بسبب عوامل إضافية ، بما في ذلك الطلب خارج الميتوكوندريا على ATP وركائز الفحص أو أحداث الإشارة ، والتي يمكن أن تضلل تفسير النتائج. بدلا من ذلك ، من الممكن أيضا استخدام مفردة أو حزم من الألياف العضلية المعزولة حديثا من العضلات. ومع ذلك ، فإن طريقة العزل صعبة تقنيا وممكنة فقط لعدد قليل من أنواع العضلات. في هذه الحالة ، يتم استخدام العضلات المثنية الرقمية (FDB) والعضلات الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) بشكل رئيسي10،12،13 ، على الرغم من أن بعض التقارير تصف استخدام أنواع العضلات الأخرى أيضا14،15.
كما تم الإبلاغ عن تنميط الطاقة الحيوية لأقسام العضلات الهيكلية 16. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن دراسة العضلات السليمة (يوضح المؤلفون أن التقطيع عبر الألياف لا يزعج النتائج عند مقارنتها بالألياف العضلية المعزولة). ومع ذلك ، فإن وصول الميتوكوندريا إلى الركائز ومثبطات الفحص محدود ، وبالتالي ، لا يمكن قياس سوى عدد قليل من المعلمات16. وأخيرا، يمكن أيضا استخدام الميتوكوندريا المعزولة9،17،18،19. في هذه الحالة ، تفقد الميتوكوندريا بيئتها الخلوية ، مما قد يؤثر على وظيفتها. في المقابل ، تضمن هذه الطريقة الوصول إلى الركائز والمثبطات ، وتمكن من تحليل عدد كبير من أنواع العينات ، وعادة ما تتطلب مواد أقل.
تصف هذه الورقة طريقة لإجراء التنميط الحيوي للميتوكوندريا المعزولة من العضلات الهيكلية للفأر باستخدام المقايسات التنفسية القائمة على الألواح الدقيقة (الشكل 1). وعلى وجه الخصوص، هناك ثلاثة بروتوكولات مفصلة: فحص الاقتران، كاليفورنيا لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC فحص تدفق الإلكترون ، EFA لقياس نشاط مجمعات ETC الفردية ؛ وفحص BOX لتحديد قدرة الميتوكوندريا على أكسدة β. والجدير بالذكر أن هناك حاجة إلى كميات صغيرة فقط من العينات مقارنة بطرق قياس التنفس التقليدية. تم تعديل بروتوكول العزل المستخدم هنا من الطريقة المنشورة في مكان آخر18.
Protocol
Representative Results
Discussion
جميع الطرق المستخدمة لدراسة التنفس الميتوكوندريا لها حدودها. وبالتالي ، من الأهمية بمكان اختيار الطريقة التي تناسب سؤالا تجريبيا محددا. يوفر هذا العمل بروتوكولا محدثا ومفصلا لعزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر لإجراء فحوصات تنفسية مختلفة للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا. والوا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر خوان ج. تينا على استخدام المجانس ومرافق البروتينات وتربية الحيوانات التابعة ل CABD للحصول على الدعم التقني. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والثقافة والرياضة الإسبانية من خلال زمالة FPU16/03264 إلى J.D.H.C. ، والرابطة الفرنسية لمكافحة اعتلال العضلات (AFM) من خلال منحة الزمالة رقم 22450 إلى C.V.-G. ، ومنحة مؤسسية MDM-2016-0687 (وحدة Maria de Maeztu Excellence ، قسم تنظيم الجينات وتكوين المورفوجينيا في CABD) و BFU2017-83150-P إلى J.J.C. منحة المجلس العسكري في الأندلس P18-RT-4572 ، وبرنامج تمويل FEDER من الاتحاد الأوروبي ، ووزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية تمنح RED2018-102576-T إلى P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
