Disse protokollene vil hjelpe brukerne med å undersøke mitokondriell energimetabolisme i 3D-kreftcellelinjeavledede sfæroider ved hjelp av Seahorse ekstracellulær fluksanalyse.
Tredimensjonale (3D) cellulære aggregater, kalt sfæroider, har blitt forkant av in vitro cellekultur de siste årene. I motsetning til dyrking av celler som todimensjonale, encellede monolag (2D-kultur), fremmer, regulerer og støtter sfæroidcellekultur fysiologisk cellulær arkitektur og egenskaper som eksisterer in vivo, inkludert uttrykk for ekstracellulære matriksproteiner, cellesignalering, genuttrykk, proteinproduksjon, differensiering og proliferasjon. Betydningen av 3D-kultur har blitt anerkjent i mange forskningsfelt, inkludert onkologi, diabetes, stamcellebiologi og vevsteknikk. I løpet av det siste tiåret har forbedrede metoder blitt utviklet for å produsere sfæroider og vurdere deres metabolske funksjon og skjebne.
Ekstracellulære fluksanalysatorer (XF) har blitt brukt til å utforske mitokondriell funksjon i 3D-mikrotissuer som sfæroider ved hjelp av enten en XF24-holmefangplate eller en XFe96 sfæroid mikroplate. Imidlertid er forskjellige protokoller og optimalisering av probing mitokondriell energimetabolisme i sfæroider ved bruk av XF-teknologi ikke beskrevet i detalj. Dette papiret gir detaljerte protokoller for sondering av mitokondriell energimetabolisme i enkle 3D-sfæroider ved bruk av sfæroidmikroplater med XFe96 XF-analysatoren. Ved hjelp av forskjellige kreftcellelinjer demonstreres XF-teknologi å være i stand til å skille mellom cellulær respirasjon i 3D-sfæroider av ikke bare forskjellige størrelser, men også forskjellige volumer, celletall, DNA-innhold og type.
De optimale mitokondrielle effektorkonsentrasjonene av oligomycin, BAM15, rotenon og antimycin A brukes til å undersøke spesifikke parametere for mitokondriell energimetabolisme i 3D-sfæroider. Dette papiret diskuterer også metoder for å normalisere data hentet fra sfæroider og adresserer mange hensyn som bør vurderes når man utforsker sfæroid metabolisme ved hjelp av XF-teknologi. Denne protokollen vil bidra til å drive forskning i avanserte in vitro sfæroidmodeller.
Fremskritt i in vitro-modeller innen biologisk forskning har utviklet seg raskt de siste 20 årene. Slike modeller inkluderer nå organ-on-a-chip-modaliteter, organoider og 3D mikrotissue-sfæroider, som alle har blitt et felles fokus for å forbedre oversettelsen mellom in vitro og in vivo studier. Bruken av avanserte in vitro-modeller, spesielt sfæroider, spenner over flere forskningsfelt, inkludert vevsteknikk, stamcelleforskning, kreft og sykdomsbiologi 1,2,3,4,5,6,7 og sikkerhetstesting, inkludert genetisk toksikologi 8,9,10, nanomaterialer toksikologi11, 12,13,14, og legemiddelsikkerhet og effekt testing 8,15,16,17,18,19.
Normal cellemorfologi er kritisk for biologisk fenotype og aktivitet. Dyrking av celler i 3D mikrotissue sfæroider tillater celler å vedta en morfologi, fenotypisk funksjon og arkitektur, mer lik den som observeres in vivo , men vanskelig å fange med klassiske monolagscellekulturteknikker. Både in vivo og in vitro påvirkes cellulær funksjon direkte av det cellulære mikromiljøet, som ikke er begrenset til cellulær kommunikasjon og programmering (f.eks. Celle-celle-kryssformasjoner, muligheter til å danne cellenisjer); celleeksponering for hormoner og vekstfaktorer i nærmiljøet (f.eks. cellulær cytokineksponering som en del av en inflammatorisk respons); sammensetning av fysiske og kjemiske matriser (f.eks. om celler dyrkes i stivvevskulturplast eller et elastisk vevsmiljø); og viktigst av alt, hvordan cellulær metabolisme påvirkes av ernæring og tilgang til oksygen, samt behandling av metabolske avfallsprodukter som melkesyre.
Metabolsk fluksanalyse er en kraftig måte å undersøke cellulær metabolisme innenfor definerte in vitro-systemer . Spesielt tillater XF-teknologi analyse av levende, sanntidsendringer i cellulær bioenergetikk av intakte celler og vev. Gitt at mange intracellulære metabolske hendelser forekommer i løpet av sekunder til minutter, er funksjonelle tilnærminger i sanntid avgjørende for å forstå sanntidsendringer i cellulær metabolsk fluks i intakte celler og vev in vitro.
Dette papiret gir protokoller for dyrking av kreftavledede cellelinjer A549 (lungeadenokarsinom), HepG2 / C3A (hepatocellulært karsinom), MCF-7 (brystadenokarsinom) og SK-OV-3 (ovarieadenokarsinom) som in vitro 3D-sfæroidmodeller ved bruk av tvungen aggregeringsmetoder (figur 1). Den beskriver også (i) i detalj hvordan man undersøker mitokondriell energimetabolisme av enkle 3D-sfæroider ved hjelp av Agilent XFe96 XF-analysatoren, (ii) fremhever måter å optimalisere XF-analyser ved hjelp av enkle 3D-sfæroider, og (iii) diskuterer viktige hensyn og begrensninger ved å undersøke 3D-sfæroid metabolisme ved hjelp av denne tilnærmingen. Viktigst beskriver dette papiret hvordan datasett samles inn som tillater beregning av oksygenforbrukshastighet (OCR) for å bestemme oksidativ fosforylering og dermed mitokondriell funksjon i cellulære sfæroider. Selv om det ikke er analysert for denne protokollen, er ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) en annen parameter som måles sammen med OCR-data i XF-eksperimenter. Imidlertid tolkes ECAR ofte dårlig eller feil fra XF-datasett. Vi gir en kommentar til begrensningene ved beregning av ECAR etter grunnleggende tilnærminger fra teknologiprodusenten.
Hovedfunn og resultater
Dette papiret gir en detaljert protokoll for å undersøke mitokondriell energimetabolisme av enkle 3D-sfæroider ved hjelp av en serie kreftavledede cellelinjer med XFe96 XF Analyzer. En metode er utviklet og beskrevet for rask dyrking av A549, HepG2 / C3A, MCF7 og SK-OV-3 cellulære sfæroider ved bruk av celleavvisende teknologier for tvungen aggregering. Denne protokollen adresserer mange hensyn ved sondering av sfæroid metabolisme med XF-teknologi, inkludert (1) optimalis…
The authors have nothing to disclose.
N.J.C ble støttet av en BBSRC MIBTP CASE Award med Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |