Dessa protokoll hjälper användare att undersöka mitokondriell energimetabolism i 3D-cancercellinje-härledda sfäroider med hjälp av Seahorse extracellulär flödesanalys.
Tredimensionella (3D) cellulära aggregat, så kallade sfäroider, har blivit ledande inom in vitro-cellodling de senaste åren. I motsats till odling av celler som tvådimensionella, encelliga monolager (2D-odling), främjar, reglerar och stöder sfäroidcellodling fysiologisk cellulär arkitektur och egenskaper som finns in vivo, inklusive uttryck av extracellulära matrisproteiner, cellsignalering, genuttryck, proteinproduktion, differentiering och proliferation. Vikten av 3D-odling har erkänts inom många forskningsområden, inklusive onkologi, diabetes, stamcellsbiologi och vävnadsteknik. Under det senaste decenniet har förbättrade metoder utvecklats för att producera sfäroider och bedöma deras metaboliska funktion och öde.
Extracellulärflödesanalysatorer (XF) har använts för att utforska mitokondriell funktion i 3D-mikrotissuer såsom sfäroider med antingen en XF24-öfångningsplatta eller en XFe96-sfäroidmikroplatta. Distinkta protokoll och optimering av sondering av mitokondriell energimetabolism hos sfäroider med XF-teknik har dock inte beskrivits i detalj. Detta dokument innehåller detaljerade protokoll för att undersöka mitokondriell energimetabolism i enstaka 3D-sfäroider med hjälp av sfäroidmikroplattor med XFe96 XF-analysatorn. Med hjälp av olika cancercellinjer har XF-tekniken visat sig kunna skilja mellan cellulär andning i 3D-sfäroider av inte bara olika storlekar utan också olika volymer, cellnummer, DNA-innehåll och typ.
De optimala mitokondriella effektorkoncentrationerna av oligomycin, BAM15, rotenon och antimycin A används för att undersöka specifika parametrar för mitokondriell energimetabolism i 3D-sfäroider. Detta dokument diskuterar också metoder för att normalisera data som erhållits från sfäroider och tar upp många överväganden som bör beaktas när man utforskar sfäroidmetabolism med XF-teknik. Detta protokoll kommer att hjälpa till att driva forskning i avancerade in vitro-sfäroidmodeller .
Framsteg inom in vitro-modeller inom biologisk forskning har snabbt utvecklats under de senaste 20 åren. Sådana modeller inkluderar nu organ-on-a-chip-modaliteter, organoider och 3D-mikrotissue-sfäroider, som alla har blivit ett gemensamt fokus för att förbättra översättningen mellan in vitro- och in vivo-studier. Användningen av avancerade in vitro-modeller, särskilt sfäroider, spänner över flera forskningsområden, inklusive vävnadsteknik, stamcellsforskning, cancer och sjukdomsbiologi 1,2,3,4,5,6,7, och säkerhetstestning, inklusive genetisk toxikologi 8,9,10, nanomaterialtoxikologi 11, 12,13,14 och läkemedelssäkerhet och effekttestning 8,15,16,17,18,19.
Normal cellmorfologi är avgörande för biologisk fenotyp och aktivitet. Odling av celler till 3D-mikrotissue-sfäroider gör det möjligt för celler att anta en morfologi, fenotypisk funktion och arkitektur, mer besläktad med den som observerats in vivo men svår att fånga med klassiska monolagercellodlingstekniker. Både in vivo och in vitro påverkas cellulär funktion direkt av den cellulära mikromiljön, som inte är begränsad till cellulär kommunikation och programmering (t.ex. cell-cell-korsningsformationer, möjligheter att bilda cellnischer); cellexponering för hormoner och tillväxtfaktorer i de omedelbara miljöerna (t.ex. cellulär cytokinexponering som en del av ett inflammatoriskt svar); Sammansättning av fysikaliska och kemiska matriser (t.ex. om celler odlas i styv vävnadsodlingsplast eller en elastisk vävnadsmiljö). och viktigast av allt, hur cellulär metabolism påverkas av näring och tillgång till syre samt bearbetning av metaboliska avfallsprodukter som mjölksyra.
Metabolisk flödesanalys är ett kraftfullt sätt att undersöka cellulär metabolism inom definierade in vitro-system . Specifikt möjliggör XF-teknik analys av levande förändringar i realtid i cellulär bioenergetik av intakta celler och vävnader. Med tanke på att många intracellulära metaboliska händelser inträffar inom några sekunder till minuter är funktionella metoder i realtid avgörande för att förstå realtidsförändringar i cellulärt metaboliskt flöde i intakta celler och vävnader in vitro.
Detta papper tillhandahåller protokoll för odling av cancer-härledda cellinjer A549 (lungadenokarcinom), HepG2 / C3A (hepatocellulärt karcinom), MCF-7 (bröst adenokarcinom) och SK-OV-3 (ovariellt adenokarcinom) som in vitro 3D-sfäroidmodeller med hjälp av tvångsaggregeringsmetoder (figur 1). Det beskriver också (i) i detalj hur man undersöker mitokondriell energimetabolism av enstaka 3D-sfäroider med hjälp av Agilent XFe96 XF-analysatorn, (ii) belyser sätt att optimera XF-analyser med hjälp av enkla 3D-sfäroider och (iii) diskuterar viktiga överväganden och begränsningar för att undersöka 3D-sfäroidmetabolism med hjälp av detta tillvägagångssätt. Viktigast av allt, detta papper beskriver hur datamängder samlas in som möjliggör beräkning av syreförbrukningshastighet (OCR) för att bestämma oxidativ fosforylering och därmed mitokondriell funktion i cellulära sfäroider. Även om det inte analyseras för detta protokoll är extracellulär försurningshastighet (ECAR) en annan parameter som mäts tillsammans med OCR-data i XF-experiment. ECAR tolkas dock ofta dåligt eller felaktigt från XF-datamängder. Vi ger en kommentar till begränsningarna för att beräkna ECAR enligt grundläggande metoder från tekniktillverkaren.
De viktigaste resultaten och resultaten
Detta dokument ger ett detaljerat protokoll för att undersöka mitokondriell energimetabolism av enstaka 3D-sfäroider med hjälp av en serie cancer-härledda cellinjer med XFe96 XF Analyzer. En metod utvecklas och beskrivs för snabb odling av A549, HepG2 / C3A, MCF7 och SK-OV-3 cellulära sfäroider med hjälp av cellavvisande tekniker för tvångsaggregering. Detta protokoll behandlar många överväganden om att undersöka sfäroidmetabolism med XF-teknik, …
The authors have nothing to disclose.
N.J.C stöddes av en BBSRC MIBTP CASE Award med Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |