Cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en fibras musculares esqueléticas mediante microscopía electrónica de transmisión
Summary
Un procedimiento modificado posterior a la fijación aumenta el contraste de las partículas de glucógeno en el tejido. Este documento proporciona un protocolo paso a paso que describe cómo manejar el tejido, realizar las imágenes y utilizar métodos estereológicos para obtener datos imparciales y cuantitativos sobre la distribución de glucógeno subcelular específico del tipo de fibra en el músculo esquelético.
Abstract
Con el uso de microscopía electrónica de transmisión, se pueden obtener imágenes de alta resolución de muestras fijas que contienen fibras musculares individuales. Esto permite cuantificaciones de aspectos ultraestructurales como fracciones de volumen, relaciones superficie/volumen, morfometría y sitios de contacto físico de diferentes estructuras subcelulares. En la década de 1970, se desarrolló un protocolo para mejorar la tinción de glucógeno en las células y allanó el camino para una serie de estudios sobre la localización subcelular del glucógeno y el tamaño de partícula de glucógeno utilizando microscopía electrónica de transmisión. Si bien la mayoría de los análisis interpretan el glucógeno como si estuviera distribuido homogéneamente dentro de las fibras musculares, proporcionando solo un valor único (por ejemplo, una concentración promedio), la microscopía electrónica de transmisión ha revelado que el glucógeno se almacena como partículas discretas de glucógeno ubicadas en distintos compartimentos subcelulares. Aquí, se describe el protocolo paso a paso desde la recolección de tejidos hasta la determinación cuantitativa de la fracción de volumen y el diámetro de partículas de glucógeno en los distintos compartimentos subcelulares de las fibras musculares esqueléticas individuales. Consideraciones sobre cómo 1) recolectar y teñir muestras de tejido, 2) realizar análisis de imágenes y manejo de datos, 3) evaluar la precisión de las estimaciones, 4) discriminar entre tipos de fibras musculares y 5) se incluyen las trampas y limitaciones metodológicas.
Introduction
Las partículas de glucógeno están compuestas por polímeros ramificados de glucosa y diversas proteínas asociadas1 y constituyen un combustible importante durante las altas demandas metabólicas2. Aunque no son ampliamente reconocidas, las partículas de glucógeno también constituyen un combustible local, donde algunos procesos subcelulares utilizan preferentemente el glucógeno a pesar de la disponibilidad de otros combustibles más duraderos como la glucosa plasmática y los ácidos grasos3,4.
La importancia de almacenar glucógeno como combustible localizado específico subcelular ha sido discutida en varias revisiones5,6 basándose principalmente en algunas de las primeras documentaciones de la distribución subcelular del glucógeno por microscopía electrónica de transmisión (TEM)7,8. Los primeros estudios utilizaron diferentes protocolos para aumentar el contraste de glucógeno desde técnicas de tinción histoquímica hasta tinciones negativas y positivas9,10. Un desarrollo metodológico importante fue el protocolo refinado de post-fijación con el osmio reducido en ferrocianuro de potasio11,12,13,14, que mejoró significativamente el contraste de las partículas de glucógeno. Este refinado protocolo no fue utilizado en algunos de los trabajos pioneros sobre el agotamiento del glucógeno inducido por el ejercicio15, sino que fue reintroducido por Graham y sus colegas16,17.
Según las imágenes en 2 dimensiones, la distribución subcelular del glucógeno se describe con mayor frecuencia como partículas de glucógeno ubicadas en tres grupos: subsarcolema (justo debajo de la membrana superficial), intermiofibrilar (entre las miofibrillas) o intramiofibrilar (dentro de las miofibrillas). Sin embargo, las partículas de glucógeno también podrían describirse como asociadas, por ejemplo, al retículo sarcoplásmico7 o núcleos18. Además de la distribución subcelular, la ventaja del contenido de glucógeno estimado por TEM es también que la cuantificación se puede realizar a nivel de fibra única. Esto permite la investigación de la variabilidad de fibra a fibra y análisis correlativos con tipos de fibra y componentes celulares como mitocondrias y gotas de lípidos.
Aquí, se describe el protocolo para el contenido volumétrico específico del tipo de fibra estimado por TEM de las tres piscinas subcelulares comunes de glucógeno (subsarcolema, intermiofibrilar e intramiofibrilar) en las fibras musculares esqueléticas. El método se ha aplicado a los músculos esqueléticos de humanos19, ratas20 y ratones21; así como aves y peces22; y cardiomiocitos de ratas23.
Protocol
Representative Results
Discussion
El paso crítico del método es el uso de osmio reducido por ferrocianuro de potasio durante la post-fijación. La selectividad de este fijador modificado para la detección de glucógeno no puede explicarse completamente por la química, pero también incluye hallazgos experimentales que demuestran que no hay detección de tales partículas en tejidos que se sabe que están libres de glucógeno o en el espacio extracelular11.
Los parámetros críticos son la precisión…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Comité Olímpico Sueco.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
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