İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi
Summary
Modifiye edilmiş bir fiksasyon sonrası prosedür, dokudaki glikojen parçacıklarının kontrastını arttırır. Bu yazıda, iskelet kasında lif tipine özgü hücre altı glikojen dağılımı hakkında tarafsız ve nicel veriler elde etmek için dokunun nasıl ele alınacağını, görüntülemenin nasıl yapılacağını ve stereolojik yöntemlerin nasıl kullanılacağını açıklayan adım adım bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
İletim elektron mikroskobu kullanımı ile, bireysel kas lifleri içeren sabit numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edilebilir. Bu, hacim fraksiyonları, yüzey alanı / hacim oranları, morfometri ve farklı hücre altı yapıların fiziksel temas bölgeleri gibi ultrayapısal yönlerin nicelleştirilmesini sağlar. 1970’lerde, hücrelerde glikojen boyamasının arttırılması için bir protokol geliştirildi ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak glikojen ve glikojen parçacık boyutunun hücre altı lokalizasyonu üzerine bir dizi çalışmanın yolunu açtı. Çoğu analiz, glikojen kas lifleri içinde homojen olarak dağılmış gibi yorumlarken, sadece tek bir değer (örneğin, ortalama bir konsantrasyon) sağlarken, iletim elektron mikroskobu, glikojenin farklı hücre altı bölmelerde bulunan ayrık glikojen parçacıkları olarak depolandığını ortaya koymuştur. Burada, doku toplanmasından, bireysel iskelet kası liflerinin farklı hücre altı bölmelerindeki glikojen hacim fraksiyonunun ve parçacık çapının kantitatif olarak belirlenmesine kadar adım adım protokol açıklanmaktadır. 1) Doku örneklerinin nasıl toplanacağı ve boyanacağı, 2) görüntü analizlerinin ve veri işlemenin nasıl yapılacağı, 3) tahminlerin hassasiyetinin nasıl değerlendirileceği, 4) kas lifi tipleri arasında ayrım yapılacağı ve 5) metodolojik tuzakların ve sınırlamaların nasıl yapılacağına ilişkin hususlar yer almaktadır.
Introduction
Glikojen partikülleri, glikozun dallanmış polimerlerinden ve çeşitli ilişkili proteinlerden1 oluşur ve yüksek metabolik talepler sırasında önemli bir yakıt oluşturur2. Yaygın olarak tanınmamasına rağmen, glikojen parçacıkları aynı zamanda bazı hücre altı proseslerin, plazma glikozu ve yağ asitleri gibi diğer ve daha uzun ömürlü yakıtların mevcudiyetine rağmen tercihen glikojen kullandığı yerel bir yakıt oluşturur3,4.
Glikojen depolamanın hücre altı spesifik lokalize bir yakıt olarak depolanmasının önemi, çeşitli derlemelerde tartışılmıştır5,6 esas olarak glikojen iletimi elektron mikroskobu (TEM)7,8 ile glikojen hücre altı dağılımının en eski belgelerinden bazılarına dayanmaktadır. İlk çalışmalarda histokimyasal boyama tekniklerinden negatif ve pozitif boyamalara kadar glikojen kontrastını arttırmak için farklı protokoller kullanılmıştır9,10. Önemli bir metodolojik gelişme, glikojen parçacıklarının kontrastını önemli ölçüde artıran potasyum ferrosiyanürle indirgenmiş osmiyum11,12,13,14 ile rafine edilmiş fiksasyon sonrası protokoldü. Bu rafine protokol, egzersize bağlı glikojen tükenmesi konusundaki öncü çalışmaların bazılarında kullanılmamıştır15, ancak Graham ve meslektaşları tarafından yeniden tanıtılmıştır16,17.
2 boyutlu görüntülere dayanarak, glikojenin hücre altı dağılımı çoğunlukla üç havuzda bulunan glikojen parçacıkları olarak tanımlanır: subsarkolemmal (yüzey zarının hemen altında), intermiyofibriller (miyofibriller arasında) veya intramiyofibriller (miyofibriller içinde). Bununla birlikte, glikojen parçacıkları, örneğin sarkoplazmik retikulum7 veya çekirdekler18 ile ilişkili olarak da tanımlanabilir. Hücre altı dağılıma ek olarak, TEM tarafından tahmin edilen glikojen içeriğinin avantajı, nicelemenin tek lif seviyesinde yapılabilmesidir. Bu, lif-lif değişkenliğinin araştırılmasına ve mitokondri ve lipit damlacıkları olarak lif tipleri ve hücresel bileşenlerle korelasyon analizlerine olanak tanır.
Burada, iskelet kası liflerindeki üç yaygın hücre altı glikojen havuzunun (subsarkolemmal, intermiyofibriller ve intramiyofibriller) TEM tarafından tahmin edilen fiber tipine özgü hacimsel içeriği için protokol açıklanmaktadır. Yöntem, insanlardan iskelet kaslarına uygulanmıştır19, sıçanlar20 ve fareler21; kuşların ve balıkların yanı sıra22; ve sıçanlardan kardiyomiyositler23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yöntemin kritik adımı, fiksasyon sonrası sırasında potasyum ferrosiyanür ile indirgenmiş osmiyum kullanılmasıdır. Glikojen tespiti için bu modifiye fiksatifin seçiciliği kimya ile tam olarak açıklanamaz, ancak aynı zamanda glikojen içermediği bilinen dokularda veya hücre dışı boşlukta bu tür parçacıkların tespit edilmediğini gösteren deneysel bulguları da içerir11.
Kritik parametreler, tahminlerin hassasiyeti ve elyaftan elyafa varyasyond…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma İsveç Olimpiyat Komitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H. Cellular mechanisms of muscle fatigue. Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -. P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes – the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. . Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
