Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בידוד של תאי גזע מזנכימליים של רקמת שומן חולדה לצורך התמיינות לתאים המייצרים אינסולין

Published: August 29, 2022 doi: 10.3791/63348
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2,3
1Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2Pharmacology and Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 3Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt

Summary

תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת השומן (Ad-MSCs) יכולים להיות מקור פוטנציאלי של MSCs המתמיינים לתאים המייצרים אינסולין (IPCs). בפרוטוקול זה, אנו מספקים שלבים מפורטים לבידוד ואפיון של Ad-MSCs אפידידימליים של חולדות, ולאחר מכן פרוטוקול פשוט וקצר ליצירת IPCs מאותם Ad-MSCs של חולדה.

Abstract

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) - במיוחד אלה שבודדו מרקמת השומן (Ad-MSCs) - זכו לתשומת לב מיוחדת כמקור מתחדש ושופע של תאי גזע שאינם מהווים חששות אתיים כלשהם. עם זאת, השיטות הנוכחיות לבידוד Ad-MSCs אינן סטנדרטיות ומשתמשות בפרוטוקולים מסובכים הדורשים ציוד מיוחד. בודדנו את ה-Ad-MSCs מהשומן האפידידימלי של חולדות ספראג-דאולי בשיטה פשוטה הניתנת לשחזור. ה-Ad-MSCs המבודדים מופיעים בדרך כלל תוך 3 ימים לאחר הבידוד, שכן התאים הדבקים מציגים מורפולוגיה פיברובלסטית. תאים אלה מגיעים למפגש של 80% תוך שבוע מבידוד. לאחר מכן, במעבר 3-5 (P3-5), בוצע אפיון מלא עבור Ad-MSCs המבודדים על ידי אימונופנוטיפ עבור אשכול MSC אופייני של סמני פני שטח התמיינות (CD) כגון CD90, CD73 ו- CD105, כמו גם גרימת התמיינות של תאים אלה לאורך השושלות האוסטאוגניות, האדיפוגניות והכונדרוגניות. זה, בתורו, מרמז על multipotency של התאים המבודדים. יתר על כן, אנו גורמים להתמיינות של ה-Ad-MSCs המבודדים לעבר שושלת התאים המייצרים אינסולין (IPCs) באמצעות פרוטוקול פשוט וקצר יחסית על ידי שילוב של מדיום הנשר המהונדס של דולבקו עתיר גלוקוז (HG-DMEM), β-מרקפטואתנול, ניקוטינמיד ואקסנדין-4. התמיינות ה-IPCs הוערכה גנטית, ראשית, באמצעות מדידת רמות הביטוי של סמנים ספציפיים של תאי β כגון MafA, NKX6.1, Pdx-1 ו-Ins1, כמו גם צביעת דיתזון עבור ה-IPCs שנוצרו. שנית, ההערכה בוצעה גם באופן פונקציונלי על ידי בדיקת הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS). לסיכום, ניתן לבודד בקלות Ad-MSCs, ולהציג את כל הקריטריונים לאפיון MSC, והם אכן יכולים לספק מקור שופע ומתחדש של IPCs במעבדה לחקר הסוכרת.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs), הידועים גם בשם תאים סטרומליים מזנכימליים, הם בין סוגי התאים הנפוצים ביותר לרפואה רגנרטיבית 1,2. הם מסווגים כתאי גזע בוגרים ומאופיינים בפוטנציאל התמיינות רב-קווית וביכולת התחדשות עצמית3. ניתן לבודד MSCs ולקבל ממקורות שונים, כולל רקמת שומן, מח עצם, דם היקפי, רקמת חבל הטבור ודם, זקיקי שיער ושיניים 4,5.

הבידוד של תאי גזע מרקמת השומן נתפס כמושך ומבטיח כאחד בשל גישתם הקלה, התפשטותם המהירה במבחנה ותפוקה גבוהה6. תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת השומן (Ad-MSCs) ניתנים לבודד ממינים שונים כגון בני אדם, בובינים, עכברים, חולדות, ולאחרונה גם עזים7. הוכח כי Ad-MSCs הם כעת מועמדים פוטנציאליים להנדסת רקמות ולטיפול גנטי/תאי שניתן אפילו להשתמש בהם כדי לפתח חלופה אוטולוגית לתיקון ארוך טווח של פגיעה ברקמות רכות או פגמים 7,8.

האגודה הבינלאומית לריפוי תאים וגנים (ISCT) הגדירה שלושה קריטריונים מינימליים שחייבים להיות מוצגים על ידי MSCs לאפיון מלא9. ראשית, הם חייבים להיות חסידי פלסטיק. שנית, MSCs צריכים לבטא סמני פני שטח של תאי גזע מזנכימליים כגון CD73, CD90 ו- CD105 וחוסר ביטוי של הסמנים ההמטופוייטיים CD45, CD34, CD14 או CD11b, CD79α או CD19 ו- HLA-DR. לבסוף, MSCs צריכים להפגין את היכולת להבדיל לשלוש שושלות מזנכימליות: אדיפוציטים, אוסטוציטים וכונדרוציטים. באופן מעניין, MSCs יכולים גם להתמיין לשושלות אחרות כגון תאים עצביים, קרדיומיוציטים, הפטוציטים ותאי אפיתל 10,11.

למעשה, ל-MSCs יש תכונות ייחודיות המאפשרות ליישם אותם כסוכנים טיפוליים פוטנציאליים בטיפול רגנרטיבי במחלות שונות. MSCs יכולים להפריש גורמים מסיסים כדי לגרום לסביבה אימונומודולטורית המספקת יתרונות טיפוליים12. בנוסף, MSCs יכולים לנדוד לעבר אתרים של פציעה ומיקרו-סביבה של גידולים כדי לספק טיפול ממוקד; עם זאת, המנגנונים אינם מובהרים במלואם13. בנוסף, ל-MSCs יש את היכולת להפריש אקסוזומים, שלפוחיות חוץ-תאיות בקנה מידה ננומטרי הנושאות מטען של רנ"א, חלבונים וגורמים מסיסים שאינם מקודדים, אשר התגלו לאחרונה כמנגנון חדשני של הפוטנציאל הטיפולי של ה-MSCs במחלות שונות14.

חשוב מכך, MSCs עוררו תשומת לב רבה לפוטנציאל שלהם להתמיין לתאים מייצרי אינסולין (IPCs), בין אם על ידי שינוי גנטי 15,16 או באמצעות שימוש בגורמים חיצוניים שונים הגורמים לתרבית במבחנה17. תקופת האינדוקציה של IPC משתנה מאוד, מכיוון שהיא תלויה בפרוטוקול האינדוקציה המשומש ובגורמים החיצוניים המנוצלים. תהליך הבידול יכול להימשך בין ימים לחודשים, והוא דורש שילוב של גורמים מעוררי אקסוגניות שיש להוסיף ו/או למשוך בשלבים שונים. רבים מהגורמים הללו ששימשו להתמיינות לבלב אנדוקרינית הם תרכובות פעילות ביולוגית שהוכחו כמקדמות את התפשטות או התמיינות/ניאוגנזה של תאי β מפרישי אינסולין ו/או מגדילות את תכולת האינסולין של IPCs 18,19,20,21. ראוי לציין כאן כי MSCs דווחו גם כבעלי השפעות טיפוליות בסוכרת ובסיבוכיה באמצעות מספר מנגנונים, כולל secretome שלהם, כמו גם מגוון רחב של פעולות ויסות חיסוני 22,23,24.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט של שלבים לבידוד ואפיון של Ad-MSCs משומן אפידידימלי של חולדות, ואחריו פרוטוקול פשוט וקצר יחסית ליצירת IPCs מ- Ad-MSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו על פי ההנחיות המאושרות, וכל ההליכים אושרו על ידי הוועדה האתית של הפקולטה לרוקחות, האוניברסיטה הבריטית במצרים (BUE), קהיר, מצרים. פרוטוקול הבידוד Ad-MSC אומץ על ידי לופז וספנסר, עם שינויים15.

1. בידוד של Ad-MSCs מרפידות שומן אפידידימליות של חולדות

  1. השתמשו בחולדות ספראג-דאולי זכריות במשקל 250-300 גרם שאינן בנות יותר מחודש (שתיים לכל בידוד). להרדים את בעלי החיים, ולאחר מכן להרדים אותם על ידי פריקה צוואר הרחם. מרססים את החיה המתת חסדת ב-70% אתנול. יש לבלות את העור ואת השריר בחלק התחתון של הבטן, ולאחר מכן לשלוף את שני האשכים כדי לחשוף את כריות השומן אפידידימלי.
  2. חתכו בעדינות את כריות השומן האפידידימליות והיזהרו שלא לחתוך את כלי הדם.
  3. מבודדים את רקמת השומן המקיפה את האפידידימיס, ואז מניחים אותה בצלחת פטרי המכילה מלוחים עם חציצת פוספט (PBS).
  4. בארון הבטיחות הביולוגית, חותכים את רפידות השומן הללו לחתיכות קטנות באמצעות מלקחיים ואזמל. העבירו את פיסות רקמות השומן החתוךות הללו לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS סטרילי.
  5. לשטוף את רקמות השומן טחון 5 פעמים עם 10 מ"ל של PBS בכל פעם כדי להסיר את הדם המזהם. יש לבצע בקפדנות את נהלי הכביסה הבאים.
    1. מוסיפים 10 מ"ל של PBS לרקמה ומערבבים היטב במשך 45 שניות. לאחר מכן, אפשרו לרקמה להתיישב באמצעות כוח הכבידה על ידי שמירה על הצינור עומד במשך 5 דקות כדי להפריד לשתי שכבות.
    2. שאפו את ה-PBS מהאינפרה-ננטנט באמצעות מזרק של 10 מ"ל והחליפו ב-10 מ"ל טריים של PBS לשטיפה נוספת.
    3. חזור על שלב שטיפה זה 4-5 פעמים עד שה- PBS נקי מדם. זה מצביע על כך שרוב הדם, אם לא כל, מוסר.
  6. לאחר הכביסה, יש להחיות את רקמת השומן ב-10 מ"ל של תמיסת קולגן (0.1% קולגן מסוג 1 ב-PBS). אטמו את הצינור בחוזקה עם פרפילם, ואז דגירו אותו באמבט מים רועד (37 מעלות צלזיוס, 80 סל"ד, למשך 45 דקות) עד שהרקמה כמעט הומוגנית.
    הערה: הימנעו מעיכול מלא של הרקמה (כאשר התמיסה הופכת להומוגנית לחלוטין עם היעלמות מוחלטת של כל שאריות/חתיכות הרקמות), מכיוון שהיא משפיעה לרעה על התרבות התאים לאחר מכן. בדרך כלל, העיכול לוקח 30-45 דקות.
  7. לאחר עיכול הקולגאז נעשה, מערבולת את הצינור במשך 15 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם. מערבולת את הצינור שוב במשך 10 שניות, ואחריה עוד צנטריפוגה של 5 דקות. לאחר מכן נצפו שלוש שכבות. יש להשליך בזהירות את שכבת השמן, ואחריה את השכבה המימית, מבלי להפריע לכדור שבר כלי הדם הסטרומלי (SVF).
    הערה: הסר את חומר העל המכיל אדיפוציטים ואת תמיסת הקולגןאז. ראשית, הסר את האדיפוציטים ואת שכבת השמן הנלווית עם פיפטה של 10 מ"ל כדי להבטיח הסרה מלאה של טיפות השמן, ולאחר מכן הסר את השכבה מימית שמתחת.
  8. בצעו החייאה של כדור ה-SVF בתחתית הצינור ב-10 מ"ל של תמיסת BSA סטרילית (1% אלבומין, תמיסת שבר V בסרום בקר ב-PBS), ולאחר מכן צנטריפוגה של הצינור למשך 5 דקות ב-300 x גרם.
  9. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו את גלולת ה-SVF ב-8.5 מ"ל של מדיה מלאה עבור Ad-MSCs (המורכבת מתערובת הנשרים המהונדסים של Dulbecco Medium/Nutrient תערובת F-12 [DMEM/F12] בתוספת 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B ו-2 mM L-גלוטמין).
  10. תרבית את התאים בבקבוק 25 ס"מ2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO2. למחרת, בדוק את התאים המצורפים, הסר את התאים המרחפים והחלף את המדיה. לאחר מכן, החליפו את התקשורת כל יומיים.
  11. מעבירים את התאים כל 5-7 ימים כאשר הם נפגשים ב-80%-90% באמצעות טריפסין-EDTA. השתמש בתאים בין מעברים 3-5 עבור הניסויים הבאים המתוארים בפרוטוקול זה. הצגה סכמטית של כל שלבי הבידוד מסופקת באיור 1.
    הערה: בדרך כלל, עוצמת Trypisn-EDTA עשויה להשתנות בין ספקים שונים, לכן נסה למזער את זמן הטריפסיניזציה כדי למנוע השפעות רעילות על התאים.

2. אפיון Ad-MSCs על ידי אימונופנוטיפ באמצעות ניתוחי ציטומטריה של זרימה

  1. במעבר 3, פיצלו את התאים באמצעות טריפסין-EDTA. לשטוף עם PBS 2 פעמים ולאחר מכן לספור את התאים עם המוציטומטר.
  2. דגירה של 100,000 תאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות עם CD90 או CD105 (סמנים מזנכימליים) או CD34 (סמן המטופויאטי) נוגדן חד שבטי המסומן בפלואורסצין-איזותיוציאנט (FITC).
  3. לשטוף את התאים ולהשעות אותם ב 500 μL של מאגר FACS. לנתח על ידי ציטומטריה זרימה25.

3. הערכת פוטנציאל ההבחנה של Ad-MSCs מבודדים לשושלות מזנכימליות שונות

  1. הבחנה אדיפוגנית
    1. יש לבצע שימוש חוזר בתאים במדיה מלאה (כמתואר בשלב 1.9), ולאחר מכן תרבית את התאים בצפיפות של 3.7 x 104 תאים/באר בצלחת תרבית רקמה של 24 בארות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה של 5% CO2. לאחר מכן, לשנות את המדיה כל 3 ימים עד שהתאים מגיעים כמעט 100% מפגש, אשר בדרך כלל לוקח 3 ימים.
    2. כאשר התאים מגיעים למפגש הרצוי, החליפו את מדיית ההתפשטות במדיית ההתמיינות האדיפוגנית (המורכבת ממדיית LG-DMEM בתוספת 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, ו-2 mM L-גלוטמין עם תוסף אדיפוגני אחד, המסופק עם ערכת הזיהוי הפונקציונלית של תאי גזע מזנכימליים) כדי לגרום לאדיפוגנזה. לאחר מכן, החליפו את המדיה כל 3 ימים (0.5 מ"ל/באר). הקפידו לבצע את החלפת המדיה בעדינות כדי לא לשבש את השומנים.
    3. לאחר 21 יום, העריכו את ההתמיינות האדיפוגנית על ידי בדיקה מיקרוסקופית של מראה השומנים ועל ידי צביעת שמן אדום.
    4. הכינו תמיסת מלאי של שמן אדום על ידי המסת 30 מ"ג של כתם שמן אדום ב-10 מ"ל של איזופרופנול, ולאחר מכן שמרו אותו לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו תמיסת עבודה על ידי ערבוב תמיסת מלאי של 3 חלקים עם 2 חלקים של מים מזוקקים כפולים (ddH2O), ערבבו אותם היטב ושמרו אותה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואז סנן לאחר מכן על ידי נייר סינון.
    5. כדי לתעד את ההתמיינות האדיפוגנית, שטפו את התאים פעמיים עם PBS, ואז תקנו אותם באמצעות פורמלין בעל מאגר נייטרלי של 10% (0.75 מ"ל/באר) למשך 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBS באמצעות 1 mL / באר ולדגום את התאים במשך 5 דקות בכל פעם. חשוב לשאוף לחלוטין את ה- PBS לפני הוספת פתרון העבודה של שמן אדום.
    6. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו את תמיסת העבודה של שמן אדום לתאים ודגרו אותם במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את תמיסת הכתם ושטף בעדינות את התאים פעמיים עם PBS. שימו לב לטיפות השומנים המוכתמות מתחת למיקרוסקופ.
  2. הבחנה אוסטאוגנית
    1. זרע 7.4 x 103 תאים/באר (0.5 מ"ל בינוני/באר) בצלחת של 24 בארות ודגירה שלהם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה לחה של 5% CO2 במדיה מלאה (כמתואר בשלב 1.9.) במשך 3 ימים כדי להגיע למפגש של כמעט 70%.
    2. לגרום לתאים את התוסף האוסטאוגני (המסופק עם הערכה) במדיית LG-DMEM בתוספת 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B ו-2 MM L-גלוטמין.
    3. ממשיכים את האינדוקציה האוסטאוגנית במשך 21 יום, ומשנים את מדיית ההבחנה כל 3 ימים.
    4. הכינו תמיסה עובדת של כתם Alizarin Red S על ידי המסת 200 מ"ג של כתם Alizarin Red S ב-9 מ"ל של ddH2O, ולאחר מכן התאימו את ה-pH ל-4.1-4.3 באמצעות אמוניום הידרוקסיד ו-HCl. לאחר מכן, להמציא את עוצמת הקול ל 10 מ"ל על ידי ddH2O. לאחר מכן, הסר את כל המשקעים על ידי סינון באמצעות נייר סינון.
    5. שטפו את התאים פעמיים עם PBS, ואז תקנו אותם באמצעות 10% פורמלין מחוזק (0.75 מ"ל/באר) למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים 2 פעמים באמצעות PBS (1 מ"ל/באר). בכל פעם, דגירה של התאים במשך 5 דקות.
    6. דגירה של התאים הקבועים עם תמיסת Alizarin-Red S המוכנה של 2% למשך 30 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
    7. לאחר מכן, הסר את תמיסת הכתם, שטפו את התאים פעמיים עם ddH2O ופעם אחת עם PBS, ולאחר מכן התבוננו במטריצה החוץ-תאית העשירה בסידן המוכתם כדי להעריך התמיינות אוסטאוגנית תחת המיקרוסקופ.
  3. הבחנה כונדרוגנית
    1. זרע 7.4 x 103 תאים/באר (0.5 מ"ל בינוני/באר) בצלחת של 24 בארות ודגירה אלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה לחה של 5% CO2 במדיה מלאה (כמתואר בשלב 1.9.) במשך 3 ימים כדי להגיע למפגש של כמעט 70%.
    2. כאשר מגיעים למפגש הרצוי, משרים את ההתמיינות הכונדרוגנית של התאים עם DMEM/F12 ללא סרום המכיל אינסולין-טרנספרין סלניום (ITS), תוסף כונדרוגני (מסופק עם הערכה), 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B ו-2 mM L-גלוטמין21.
    3. הדגירו את התאים עם המדיה הכונדרוגנית למשך 21 יום, תוך שינוי מדיית ההתמיינות הכונדרוגנית כל 3 ימים.
    4. הכינו תמיסת עבודה של כתם Alcian Blue 8GX באופן הבא: ראשית, הכינו תמיסת חומצה אצטית קרחונית של 3% ב-ddH2O על ידי הוספת 3 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ל-97 מ"ל של ddH2O. לאחר מכן, הכינו תמיסת עבודה של כתם Alcian Blue 8GX על ידי ערבוב של 0.1 גרם ב-100 מ"ל של תמיסת חומצה קרחונית של 3%, והסירו את כל המשקעים על ידי סינון באמצעות נייר סינון.
    5. שטפו את התאים פעמיים עם PBS, ואז תקנו אותם באמצעות 10% פורמלין מחוזק (0.75 מ"ל/באר) למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים 2 פעמים באמצעות PBS (1 מ"ל/באר). בכל פעם, דגירה של התאים במשך 5 דקות.
    6. השלב הבא הוא לדגום את התאים בכתם 8GX הכחול 0.1% מוכן 0.1% אלקיאן ב 3% חומצה אצטית קרחונית במשך 60 דקות ב 37 °C (84 °F). לשטוף את התאים המוכתמים 2 פעמים עם ddH2O ופעם אחת עם PBS, ולאחר מכן לצפות בפרוטאוגליקנים הגופרתיים המוכתמים מתחת למיקרוסקופ.

4. הבחנה בין Ad-MSCs ל-IPCs

  1. במעבר 3, פיצלו את ה-Ad-MSCs באמצעות טריפסין-EDTA. ראשית, הסר את המדיה, ולאחר מכן לשטוף את התאים כאשר עדיין מחוברים בבקבוק התרבית עם 5 מ"ל של PBS. לאחר מכן, הוסף 5 מ"ל של טריפסין - EDTA לבקבוק 75 ס"מ2 ודגירה ב 37 ° C למשך 3-10 דקות.
    הערה: נסו לגרום לתאים במעברים מוקדמים, בדרך כלל בין P3-P5, שכן מעברים מאוחרים משפיעים לרעה על תכונות התאים ויכולות ההתמיינותשלהם 17,24.
  2. לאחר מכן, בדקו את התאים לניתוק ולהיותם תרחיף חד-תאי. הוסף 5 מ"ל של מדיית DMEM/F12 מלאה לבקבוקון כדי לעכב את פעולת הטריפסין. אסוף את מתלי התא והעביר אותו לצינור של 15 מ"ל, ולאחר מכן הוסף עוד 5 מ"ל של מדיית DMEM/F12 מלאה לצינור.
  3. צנטריפוגה של התאים ב-300 x g במשך 2 דקות כדי להעיף את התאים.
  4. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS, צנטריפוגה שוב ב 300 x g במשך 2 דקות, ולאחר מכן resuspended את גלולת התא ב 3-5 מ"ל של מדיה DMEM / F12 מלאה.
  5. ספרו את התאים באמצעות צבע הרחקה כחול טריפאן והמוציטומטר.
  6. לאחר מכן, זרעו את התאים בלוחות של 6 בארות (1 x 106 תאים/צלחת) וצלחת של 12 בארות (לבדיקת GSIS; 1 x 106 תאים/צלחת) ודגרו באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במדיה מלאה (כמתואר בשלב 1.9.) במשך 3 ימים כדי להגיע למפגש של כמעט 90%.
  7. ביום האינדוקציה, הסירו את המדיה, שטפו את התאים ב-PBS, ולאחר מכן דחפו את התאים למשך יומיים על ידי מדיה טרום אינדוקציה (DMEM/F12 בתוספת 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 2 mM L-גלוטמין, 10 mM ניקוטינמיד [NA], ו-1mM β-mercaptoethanol [β-ME]).
  8. לגרום לתאים למשך יום אחד נוסף באמצעות DMEM עתיר גלוקוז (HG-DMEM, 4.5 גרם/ל' גלוקוז) בתוספת 2.5% FBS, 100 פניצילין U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 2 mM L-גלוטמין, 10 mM NA ו-1mM β-mercaptoethanol. איסוף כדורי תאים בסוף שלב זה (המיועדים לתאי D3 בפרוטוקול זה).
  9. דגירה של התאים למשך 7 ימים נוספים במדיית האינדוקציה הסופית של התמיינות המורכבת מ-HG-DMEM בתוספת 2.5% FBS, 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 2 mM L-גלוטמין, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoethanol ו-10 ננומטר אקסנדין-4.
  10. בסוף התקופה שצוינה, אספו כדורי תאים (הנקראים סופיים בפרוטוקול זה), והעריכו את ההתמיינות המוצלחת של התאים על ידי צביעת DTZ ובדיקת GSIS, כדלקמן בפרוטוקול זה.
  11. הערך את ה- IPCs שנוצרו על-ידי ביצוע שלבים 5 ו- 6 להלן.

5. צביעת דיתיזון

  1. הכן את תמיסת מלאי הכתמים של דיתיזון (DTZ) באופן הבא: ממיס לחלוטין 25 מ"ג של DTZ ב-2.5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO), מחלקים לאליפוטים ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס בחושך עד לשימוש.
  2. לצורך צביעה, הכינו תמיסת עבודה 1:100 (נפח/נפח) על ידי דילול תמיסת המלאי במדיום תרבית שלם (HG-DMEM בתוספת 5% FBS, פניצילין 100 U/mL, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B ו-2 מ"מ ל-גלוטמין). לאחר מכן, סנן את הפתרון העובד באמצעות מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר.
  3. לאחר מכן, עבור תאי התרבית המכתימים DTZ שצוינו בצלחת של 6 בארות, ולאחר שאיפת מדיית התרבית, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן הוסיפו 2 מ"ל של תמיסת עבודה DTZ לכל באר. אינקובציה למשך 2 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 .
  4. בזהירות לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBS. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 2 מ"ל של PBS לכל באר. לאחר מכן, התבונן ב- IPCs המוכתמים באדום ארגמן תחת מיקרוסקופ הפוך. השתמש ב- Ad-MSCs לא מושתקים שתורבתו בתחילה במדיום צמיחה מלא (10% FBS - DMEM /F12) כבקרה.

6. ביטוי גנים של סמני תאי β על ידי RT-qPCR

  1. מיצוי RNA
    1. לאחר ההתמיינות, אספו את כדורי התא ואחסנו אותם בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. השהו כל כדור תא (שמקורו בשש הבארות של צלחת אחת בת 6 בארות) ב-1 מ"ל של ריאגנט מיצוי RNA של גואנידיום תיוציאנט בצינור נטול נוקלאז של 1.5 מ"ל, יחד עם צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה של הדגימות השחוקות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לאפשר דיסוציאציה מוחלטת של מתחמי הנוקליאופרוטאינים.
    2. הוסיפו 200 μL של כלורופורם לכל 1 מ"ל של ריאגנט מיצוי RNA, וכיסו בבטחה את הצינורות כדי שינערו אותם במרץ ביד במשך 15 שניות. לאחר מכן, דגירה במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. צנטריפוגה את הדגימות ב 13,800 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (64 °F). זה יוביל להפרדת תערובת לפאזה כלורופורמית תחתונה, אינטרפאזה ופאזה מימית עליונה חסרת צבע, כאשר הרנ"א יישאר בשלב מימי.
    4. ממקמים את הפאזה המימית העליונה בצינור חדש, תוך הימנעות זהירה מלגעת באינטרפאזה.
    5. הוסף 600 μL של 100% איזופרופנול לשלב מימי (נפח 1:1), ואז ערבב את הדגימות ביסודיות על ידי היפוך 25 פעמים, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    6. צנטריפוגה הדגימות ב 18,800 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (64 °F). הרנ"א המחודד יוצר כדור קטן דמוי ג'ל בצד הצינור.
    7. מוציאים את חומר העל ושוטפים את הכדורים ב-1 מ"ל של אתנול קר כקרח של 80%. לאחר הוספת האתנול, לבצע באיטיות צינורות מרובים של גלולת ה- RNA במשך 10 שניות.
    8. צנטריפוגה את הדגימות במשך 5 דקות ב 9,600 x g ב 4 °C (64 °F). השליכו את הסופרנטנט והשאירו את כדורי הרנ"א לייבוש באוויר למשך 5-10 דקות.
    9. לאחר הייבוש, ממיסים את כדורי ה-RNA ב-25-100 μL של מים נטולי RNase (על פי גודל הכדור הראשוני) על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים עד לסולוביזציה מלאה בצינורות נטולי נוקלאז של 1.5 מ"ל. הימנע ייבוש מוגזם של גלולת RNA.
      הערה: בדרך כלל, הכדור הופך שקוף כאשר הוא מתייבש. עם זאת, ברגע שזה ברור, מיד resuspened אותו כדי למנוע יובש מוגזם של הכדור.
    10. לכמת את הרנ"א על ידי קביעת הצפיפויות האופטיות (OD) ב-260 ננומטר וב-280 ננומטר, תוך שימוש במים נטולי נוקלאז כריקים.
    11. ודא שלדוגמאות יש OD260/OD280 = 1.8-2.0.
  2. סינתזת cDNA
    1. סינתזו cDNA מהרנ"א הכולל המבודד באמצעות ערכת סינתזה של cDNA.
    2. בצע את תגובת הסינתזה של cDNA על פי הוראות היצרן. בצינור PCR של 200 μL, הוסף נפח של תמיסת RNA המכילה 0.5 מיקרוגרם של RNA כולל לתערובת הראשית של התגובה המוצגת בטבלה 1.
    3. לאחר הוספת הרנ"א לתערובת הראשית, הזינו את התערובת דרך תוכנית רכיבה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות למשך מחזור אחד, ולאחר מכן מחזור השבתה של 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, באמצעות מחזור תרמי.
    4. דיללו את ה-cDNA באמצעות מים נטולי נוקלאז לריכוז סופי של 2 ננוגרם/μL. אחסנו ב-20 מעלות צלזיוס עבור RT-qPCR שלאחר מכן.
  3. RT-qPCR באמצעות SYBR ירוק מאסטר מיקס
    1. בצע את תגובת RT-qPCR עבור כל גן מטרה באמצעות תבנית cDNA בהתאם לתמהיל התגובות המוצג בטבלה 2. לעשות את כל האמצעים במשולש.
    2. קבוצות הפריימרים שבהם נעשה שימוש מוצגות בטבלה 3. בצע את כל הליכי RT-qPCR על קרח.
    3. בצע את תגובת RT-qPCR באמצעות מכונת PCR בזמן אמת בהגדרות תוכנית ברירת המחדל. תנאי המחזור התרמי כללו דנטורציה ראשונית של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 45 מחזורים של דנטורציה (95 מעלות צלזיוס, 15 שניות) וחישול/הרחבה משולבים (60 מעלות צלזיוס, דקה אחת).
    4. קבע את ערכי Ct וזהה את רמות הביטוי בהתאם ל- 2-ΔΔC, עם β-אקטין כבקרה פנימית.

תערובת מאסטר של סינתזת cDNA נפח (μl)
מאגר סינתזה cDNA 5x 4
dNTP 2
פריימר RNA 1
תערובת אנזים Verso 1
משפר RT 1
מים ללא נוקלאז משתנה
סה"כ רנ"א משתנה
נפח התגובה הכולל 20

טבלה 1: נפחי תערובת מאסטר של סינתזת cDNA.

תערובת תגובות RT-qPCR נפח (μl) ריכוז סופי ב 10 μL
cDNA 2 2 נ"ג/באר
RT-qPCR פריימר קדימה (3 μM) 1 300 ננומטר
RT-qPCR פריימר הפוך (3 μM) 1 300 ננומטר
מים ללא נוקלאז 1 -------
2x SYBR ירוק מיקס מאסטר 5 1x
נפח התגובה הכולל 10

טבלה 2: תערובת תגובות RT-qPCR.

גן פריימר קדמי פריימר הפוך
פוקסה2 GAGCCGTGAAGATGGAAGG ATGTTGCCGGAACCACTG
PDX-1 ATCCACCTCCCGGACCTTTC CCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
NKX6.1 ACACCAGACCCACATTCTCCG ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT
מאפה TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT CCGCCAACTTCTCGTATTTC
Ins-1 CACCTTTGTGGTCCTCACCT CTCCAGTGCCAAGGTCTGA
β-אקטין TGGAGAAGATTTGGCACCAC AACACAGCCTGGATGGCTAC

טבלה 3: רצפי פריימרים קדימה ואחורה.

7. הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז

  1. הכנת חיץ ביקרבונט רינגר של קרב (KRB) של קרב
    1. הכינו את תמיסת המאגר של קרבס רינגר ביקרבונט (KRB) עם ריכוזי גלוקוז של 2 מ"מ (גלוקוז נמוך) וריכוז גלוקוז של 20 מ"מ (גלוקוז גבוה) לצורך בדיקת הפרשת האינסולין (GSIS) המעוררת על ידי גלוקוז. הרכיבים המשמשים להכנת מאגר KRB מופיעים בטבלה 4.
    2. התאם את ה- pH של המאגר באמצעות 1 N HCl לכ- 7.25-7.35 (כלומר, 0.1-0.2 יחידות מתחת ל- pH 7.4 הרצוי, מכיוון שהוא עשוי לעלות במהלך סינון).
    3. הוסיפו אלבומין בסרום בקר (BSA) טרי בריכוז של 0.1% (משקל/נפח).
    4. הוסיפו גלוקוז לאחר מכן (18 מ"ג ל-50 מ"ל של KRB כדי להכין את מאגר ה-KRB של 2 mM דל גלוקוז, ו-180 מ"ג עבור 50 מ"ל של KRB כדי להכין את מאגר ה-KRB עתיר הגלוקוז של 20 mM).
    5. עיקרו את מאגרי LG ו-HG KRB המוכנים על ידי סינון דרך מסנן מזרקים של 0.2 מיקרומטר כדי להיות מוכנים לבדיקת GSIS.
  2. בדיקת GSIS
    1. בתחילה זרעו 1 x 105 תאים/באר בצלחת תרבית תאים של 12 בארות והשרות תאים אלה על ידי שימוש באותו פרוטוקול אינדוקציה של התמיינות בדיוק.
    2. בסוף פרוטוקול האינדוקציה, שטפו בעדינות את ה-IPCs שנוצרו (בצלחת) פעמיים עם PBS ופעם אחת עם LG-KRB.
    3. לאחר מכן, דגירו את ה-IPCs עם 300 μL של LG-KRB/well למשך שעה אחת, ולאחר מכן השליכו את המאגר הזה.
    4. לאחר מכן, דגירה של ה- IPCs עם 300 μL של 2 mM (LG) או 20 mM (HG) מאגר KRB למשך שעה אחת נוספת. בסוף תקופת הדגירה, אספו את ה-supernatant ואחסנו ב-−80 מעלות צלזיוס עבור בדיקת האינסולין המופרשת שלאחר מכן באמצעות ערכת ELISA מסחרית ובעקבות הוראות היצרן.
      הערה: נסה להיות עדין ככל האפשר בעת שאיפה או הוספה של מאגר PBS ו- KRB בעת ביצוע בדיקת GSIS.
רכיב ריכוז
מגנזיום כלוריד (נטול מים) 0.0468 גרם/ליטר
אשלגן כלורי 0.34 גרם לליטר
נתרן כלורי 7.00 גרם לליטר
נתרן פוספט דיבאסיק (נטול מים) 0.1 גרם/ל'
נתרן פוספט מונובאסיק (נטול מים) 0.18 גרם/ל'
נתרן ביקרבונט 1.26 גרם לליטר
סידן כלוריד 0.2997 גרם/ליטר

טבלה 4: הרכיבים המשמשים להכנת מאגר KRB.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. ציין את כל הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). כל ההשוואות נעשו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ומבחן הפוסט-הוק של טוקי באמצעות תוכנה סטטיסטית. תוצאות עם ערכי p **p ≤ 0.01 ו- *p ≤ 0.05 נחשבו מובהקות סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידוד ואפיון של Ad-MSCs
כפי שניתן לראות באיור 2, התאים המבודדים מרקמת השומן הראו אוכלוסייה הטרוגנית של תאים מעוגלים דמויי פיברובלסטים החל מיום הבידוד שלמחרת (איור 2A). 4 ימים לאחר הבידוד, התאים הפיברובלסטים החלו לגדול במספרם ובגודלם ולגדול כאוכלוסייה הומוגנית על ידי מעבר 1 (איור 2B,C). תאים אלה המשיכו לגדול כתאים דמויי פלסטיק, דמויי פיברובלסטיים, כפי שהוכח עד מעבר 3, תוך מילוי הקריטריון הראשון של מאפייני MSC (איור 2D). Ad-MSCs אלה הראו מאפייני תרבות טובים מאוד, ופרוטוקול זה נמצא כפרוטוקול רלוונטי, קל ומהיר יחסית לבידוד Ad-MSCs מרפידות שומן אפידידימליות.

השלב הבא היה לאפיין את ה-Ad-MSCs המבודדים. על פי ISCT, MSCs צריכים לעקוב אחר שלושת הקריטריונים של הדבקות בפלסטיק, ביטוי של תקליטורים מזנכימליים עם חוסר סמנים המטופויאטיים, והיכולת להבדיל לאדיפוציטים, אוסטוציטים וכונדרוציטים. כפי שניתן לראות באיור 3A, ניתוח הציטומטריה של הזרימה הראה שרוב התאים האלה ביטאו CD90 ו-CD105 (76.4% ו-73.6%, בהתאמה). בינתיים, הם היו כמעט שליליים עבור CD34 (0.1%).

יתר על כן, עם אינדוקציה של התמיינות של תאים אלה, הם הראו את היכולת להתמיין לתוך אדיפוציטים, אוסטוציטים, וכונדרוציטים. כפי שניתן לראות באיור 3B (הפאנל העליון), האדיפוציטים הראו צביעה באדום שמן של vacuoles שומנים בהשוואה לתאים לא מושתים בעלי שליטה. האוסטוציטים הראו צביעה אופיינית לאדום אליזרין (איור 3B, לוח אמצעי) בהשוואה לתאי בקרה. לבסוף, תאים המושרים על ידי כונדרוציטים הראו כתמים כחולים של המטריצה החוץ-תאית בהשוואה לתאים שאינם מושרים לשליטה (איור 3B, פאנל תחתון).

נתונים אלה מצביעים בבירור על כך שתאים מבודדים מרקמת השומן לא רק מפגינים מאפייני תרבית טובים, אלא גם מציגים את כל הקריטריונים המוצעים עבור MSCs.

התמיינות של Ad-MSCs לתאים המייצרים אינסולין (IPCs)
כפי שניתן לראות באיור 4A, השתמשנו בפרוטוקול קצר ופשוט יחסית כדי להבדיל בין Ad-MSCs ל-IPCs. לאחר אינדוקציה של התמיינות, ה-IPCs המושרים הוערכו במספר דרכים. התאים המושרים הראו שינויים מורפולוגיים ניכרים. כפי שניתן לראות באיור 4B (הלוח העליון), התאים המושרים הראו מורפולוגיה מעוגלת, דמוית אשכול, בהשוואה למורפולוגיה הנורמלית דמוית פיברובלסטית של Ad-MSCs. באופן מעניין, עם הכתמתם בדיתזון, האשכולות האלה הראו כתם ארגמן, שהוא מאפיין של גרגירי אבץ של כתם β-תאי (איור 4B, פאנל תחתון).

לאחר מכן, ה-IPCs שנוצרו הוערכו גנטית לביטוי הסמנים הספציפיים של תאי β בהשוואה לתאי הבקרה הלא-מושרשים. כפי שניתן לראות באיור 5A-E, התאים המושרים הצליחו לבטא סמנים ספציפיים שונים של תאי β, מה שמעיד על יכולתם ליצור IPCs. באשר ל-FOXA2 - סמן אנדודרם סופי (כפי שמוצג באיור 5A)-, הוא התבטא מאוד בהתמיינות D3 בהשוואה לשליטה, והגיע לכמעט פי 30 ואז ירד לפי 10 בלבד מהבקרה בתאים הממוינים הסופיים (D3: 28.37 ± 0.88; גמר: 12.10 ± 1.27; עמ' < 0.05). באשר ל-Pdx-1 (שנחשב לסמן מוקדם של תאי β), הוא הועלה הן ב-D3 והן בתאים שהתמיינו סופית, והגיע לכמעט פי 20 בהשוואה לתאי בקרה לא מושרשים (D3: 22.39 ± 5.14; גמר: 17.13 ± 0.342; עמ' < 0.05; איור 5ב). לגבי הסמנים האחרים של תאי β, כלומר NKX6.1, MafA ואינסולין-1 (Ins1), כולם הראו גובה החל מ-D3 ועד התמיינות סופית, והגיעו כמעט פי 8, פי 12 ופי 300, בהתאמה, בהשוואה לתאים לא מושרשים בשליטה (NKX6.1: D3: 1.94 ± 0.86, סופי: 7.97 ± 1.34, p<0.05; MafA: D3: 6.59 ± 0.4, סופי: 11.54 ± 2.40, p < 0.05; ו-Ins1: D3: 27.29 ± 20.27, סופי: 318.20 ± 76.09, p < 0.05) (איור 5C-E). זה מצביע על כך ש- Ad-MSCs אלה יכולים להבדיל ל- IPCs המבטאים סמנים β-תאיים.

לבסוף, תאים אלה הוערכו להפרשת אינסולין כאשר הם מאותגרים עם ריכוזים הולכים וגדלים של גלוקוז. כפי שניתן לראות באיור 5F, האינסולין שהופרש בסופר-נטנט של ה-IPCs המושרים כאשר אותגרו עם גלוקוז של 20 mM היה גבוה משמעותית מזה שהופרש כאשר התאים אותגרו עם גלוקוז של 2 mM (HG: 390 pg/mL ± 33 pg/mL; LG: 234 pg/mL ± 32 pg/mL, p < 0.05; איור 5F)

נתונים אלה אישרו כי הפרוטוקול המשומש הצליח להבדיל את ה- Ad-MSCs ל- IPCs, אשר אושרו גנטית ותפקודית.

Figure 1
איור 1: הצגה סכמטית של שלבי הפרוטוקול המשמשים לבידוד ואפיון של Ad-MSCs. נוצר על ידי Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: פוטומיקרוגרפים המראים את ה-Ad-MSCs המבודדים. (A) תאים מבודדים המציגים מורפולוגיה דמוית פיברובלסטים הדבקים בפלסטיק מתחילים להופיע יום לאחר הבידוד. (B) עם הזמן, ה-Ad-MSCs הדביקים האלה (עם מורפולוגיה דמוית פיברובלסטים) מתרבים וגדלים במספרם, ומגיעים לאוכלוסייה דמוית פיברובלסטים הומוגנית יותר ב-(C) P1 ו-(D) P3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אפיון של Ad-MSCs. (A) ניתוח ציטומטרי של זרימה של Ad-MSCs מראה שתאים אלה הם כמעט שליליים עבור CD34 (פאנל עליון), בעוד שרוב התאים מבטאים CD90 ו- CD105 (פאנל תחתון). Ad-MSCs יכולים להתמיין לשלוש שושלות מזנכימליות, כלומר (B) אדיפוציטים (שבהם טיפות שמן מוכתמות באדום שמן), (C) אוסטוציטים, מוכתמים באדום אליעזרין, ו-(D) כונדרוציטים, המוכתמים על ידי כחול אלקי (בהשוואה לשליטה בתאים לא מושרשים). שליטה: תאים לא מושרשים, Diff: תאים ממוינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הבחנה של Ad-MSCs ל-IPCs. (A) הצגה סכמטית של פרוטוקול ההבחנה המשמש ליצירת IPCs מ-Ad-MSCs, יחד עם פוטומיקרוגרפים עבור התאים בכל שלב במהלך אינדוקציה של התמיינות כלפי IPCs. עם התמיינות, תאים מאבדים את המורפולוגיה הפיברובלסטית שלהם ונוטים לצבור אשכולות יוצרים, אשר נוטים להתנתק ולגדול במדיית ההשעיה. (B) פוטומיקרוגרפים מראים בקרת Ad-MSCs ו-IPCs שנוצרו על-ידי הפרוטוקול הנ"ל המציגים שינויים מורפולוגיים עגולים באשכולות (פאנל ימני) בהשוואה למורפולוגיה דמוית פיברובלסט של ה-Ad-MSCs הלא מושרים (פאנל שמאלי), שאינם מוכתמים (פאנל עליון), או מוכתמים ב-DTZ (פאנל תחתון).
שליטה: תאים לא מושרים; IPCs: תאים המייצרים אינסולין; NA: ניקוטינמיד; β-ME: בטא מרקפטואתנול; D3: תאים מושרים ביום 3 במהלך אינדוקציה של התמיינות כלפי IPCs; D10: IPCs מובחנים סופיים בסוף פרוטוקול האינדוקציה; Ex-4: exendin-4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: רמות ביטוי יחסיות של סמני β-תאים ו-GSIS עבור IPCs. רמות ביטוי יחסיות לפי qRT-PCR עבור (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA ו-(E) Ins-1. (F) רמות של אינסולין מופרש בסופרנטנט כאשר מאתגרים את ה-IPCs הנוצרים עם גלוקוז של 2mM (LG) או 20mM גלוקוז (HG). בקרה: Ad-MSCs לא מושרשים, יום-3: תאים ממוינים שנאספו ב-D3; גמר: IPCs מובחנים סופיים; LG: גלוקוז נמוך; HG: גלוקוז גבוה. a: הממוצע שונה משליטה ב-p < 0.05; ב: הממוצע שונה מיום-3 בעמ' < 0.05; *: הממוצע של LG שונה מ-HG בעמ' < 0.05; ההשוואה נעשתה באמצעות מבחן t דגימות עצמאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, הצלחנו להציג פרוטוקול מפורט לבידוד של Ad-MSCs משומן אפידידימלי של חולדות ולהבחנה של Ad-MSCs אלה ל- IPCs. למעשה, שומן אפידידימלי של חולדות הוא מקור קל להשגה של רקמת שומן לקבלת Ad-MSCs ואינו דורש כל ציוד מיוחד, לא לאיסוף ולא לעיבוד 15,26,27. ה-Ad-MSCs המבודדים הראו הרחבת תרבות מצוינת והציגו את כל הקריטריונים שיש להגדירם כ-MSCs. הפרוטוקול המשומש תואר בעבר בשינויים קלים15. פרוטוקול זה הוכח כיעיל וניתן לשחזור. התאים הראו מורפולוגיה דמוית פיברובלסטי מהיום הראשון לאחר הבידוד והמשיכו להתרחב עד שהגיעו לאוכלוסייה הומוגנית. באופן מעניין, השתמשנו באותו פרוטוקול כדי לבודד Ad-MSCs אנושיים מ-lipo-aspirate עם הצלחה דומה לרקמת החולדה (נתונים שלא הוצגו). המגבלה היחידה של תהליך זה היא העיכול הכימי באמצעות קולגן כאשר מניחים אותו לצד לצד עם עיכול מכני בפרוטוקולים אחרים28. שלב זה מייצג גם מדד קריטי, שכן העיכול הכימי של התאים יכול להשפיע לרעה על יכולת הקיום שלהם 29,30. אחרת, פרוטוקול זה מציע התחלה טובה לכל חוקר שישקול להשיק קו מחקר Ad-MSC במעבדה שלו.

השימוש ב-MSCs לטיפול בסוכרת פתח מסלולים חדשים ונתן תקוות חדשות לטיפול בסוכרת. עם זאת, הדור של IPCs בשלים לחלוטין מ- MSCs עדיין נתון לוויכוח ולאתגר31. נכון לעכשיו, ישנם מספר פרוטוקולים לגרימת ההבחנה של MSCs כלפי IPCs בספרות. פרוטוקולים אלה משתמשים בשפע של תרכובות כימיות וגורמי גדילה לפרקי זמן שונים 20,32,33. גורמים אלה תלויים בעיקר בסוג MSC ובמקור כדי להתחיל עם34,35. עם זאת, קבלת IPCs פונקציונליים בוגרים מ- MSCs היא עדיין עניין של ויכוח ומחקר בתחום20.

בפרוטוקול המוצג, אנו מספקים דרך קצרה, פשוטה יחסית ויעילה להשיג IPCs פונקציונליים מ- Ad-MSCs. התאים שהתקבלו הראו שינויים מורפולוגיים ניכרים עם צביעת DTZ חיובית, ביטאו את רוב הסמנים של תאי β והראו הפרשת אינסולין מוגברת בתגובה לעלייה בריכוז הגלוקוז. כל הראיות הללו מאשרות את היעילות של פרוטוקול זה כפרוטוקול אינדוקציה של β תאים מ- Ad-MSCs. השתמשנו בפרוטוקול זה בסוג אחר של MSCs, כלומר MSCs ג'לי של וורטון אנושי (WJ-MSCs), שמקורם בחבל הטבור, והוא למעשה הראה תוצאות דומות21,36. תוצאות אלה מצדיקות לנסות את הפרוטוקול שלנו על סוגים ומקורות אחרים של MSCs, מה שהופך את ההליך לפרוטוקול אוניברסלי ליצירת IPCs מ- MSCs. ראוי לציין את החשיבות של גרימת התאים במעברים מוקדמים, בדרך כלל בין P3-P5, שכן מעברים מאוחרים משפיעים לרעה על תכונות התאים ויכולות ההתמיינותשלהם 17,24.

כאמור, השגת תאי β בשלים לחלוטין מ-MSCs היא נושא לוויכוח ורחוק מלהיות הבהרה מוחלטת. עם זאת, פרוטוקולים כאלה כמו אלה המתוארים כאן מספקים אמצעי פשוט ומהיר כדי להבין טוב יותר את המנגנונים הבסיסיים של ההבחנה של Ad-MSCs, או אפילו סוגים אחרים של MSCs, לתוך IPCs. היכולת של התרכובות הנוספות לאינדוקציה של ה- Ad-MSCs לבטא סמנים ספציפיים של תאי β מספקת כלי שימושי לחקר הגורמים הגנטיים והאפיגנטיים השולטים בהתמיינות של MSCs ל- IPCs. בנוסף, הפרוטוקול המהיר והפשוט מאפשר לחוקרים לחקור גורמים פנימיים אחרים שעשויים לשפר את התוצאה של הבחנה כזו. גורמים אלה עשויים לייצג טיפול אדג'ובנטי עם תאי גזע או אפילו עשויים לספק שיטה טיפולית לסוכרת. במעבדה שלנו, השתמשנו בגישה דומה כדי להוכיח שאובסטטין, הורמון מעיים, יכול להיות גורם פוטנציאלי חדשני ליצירת IPCs מ-WJ-MSCs37.

ראוי גם להזכיר כי הפרוטוקול הנוכחי יש שתי מגבלות עיקריות. ראשית, כאמור, השתמשנו בעיכול כימי על ידי קולגןאז, אשר יכול להשפיע לרעה על הכדאיות של התאים 29,30. שנית, השתמשנו בתהליך ההבחנה במבחנה ולא חקרנו את שיפור ההבשלה וההבחנה הנוסף הצפוי של ה-IPCs שנוצרו in vivo. חשוב לציין כי השתלה של MSCs מתמיינים במבחנה לתוך IPCs הראתה אינדוקציה עמוקה של הביטוי של סמנים שונים של β תאים. עלייה זו הגיעה לכ-100 פעמים 12-18 חודשים לאחר ההשתלה ב-vivo38. לפיכך, מחקרים עתידיים כדי להמשיך לחקור את ההבשלה in vivo של IPCs שנוצרו על ידי פרוטוקול פשוט זה יהיה בעל ערך טוב.

לסיכום, סיפקנו פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון של Ad-MSCs, ולאחר מכן פרוטוקול פשוט, מהיר ויעיל יחסית ליצירת IPCs מ-Ad-MSCs. פרוטוקולים אלה לא רק מספקים כלי יעיל לייזום קו מחקר של טיפול בתאי גזע, אלא גם יכולים לסייע בפיתוח התחום ההולך וגדל של טיפול בתאי MSC לסוכרת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים השותפים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים הקשור לעבודה זו.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר רודה סמיר מוחמד, MSc, מומחית לווטרינריה, הפקולטה לרוקחות, האוניברסיטה הבריטית של מצרים (BUE) על שסייעה בניתוח החולדות.

כמו כן, ברצוננו להודות ולהעריך את מאמציה של הפקולטה לתקשורת המונים, האוניברסיטה הבריטית במצרים (BUE) להפקה ועריכה של הסרטון של כתב יד זה.

ברצוננו להודות למיס פאטמה מסעוד, MSc, עוזרת מרצה לאנגלית, האוניברסיטה הבריטית במצרים (BUE) על התיקון וההגהה בשפה האנגלית של כתב היד.

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המרכז למחקר ופיתוח תרופות (CDRD), הפקולטה לרוקחות, האוניברסיטה הבריטית במצרים (BUE), קהיר, מצרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin, bovine serum Fraction V MP Biomedicals
Alcian Blue 8GX Sigma-Aldrich, USA A3157
Alizarin Red S Sigma-Aldrich, USA A5533
Ammonium hydroxide Fisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITC Stem Cell Technologies 60024FI
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3912
Calcium Chloride Fisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITC Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA MA1-19594
CD34 Polyclonal Antibody Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA PA5-85917
Chloroform Fisher Scientific, USA
Collagenase type I, powder Gibco, Thermo Fisher, USA 17018029
D-Glucose anhydrous, extra pure Fisher Scientific, Germany G/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific, Germany BP231-100
Dithizone staining Sigma-Aldrich, USA D5130
DMEM - High Glucose 4.5 g/L Lonza, Switzerland 12-604F
DMEM - Low Glucose 1 g/L Lonza, Switzerland 12-707F
DMEM/F12 medium Lonza, Switzerland BE12-719F
DNAse/RNAse free water Gibco Thermo Fisher, USA 10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology grade Sigma-Aldrich, Germany 24103
Exendin-4 Sigma-Aldrich, Germany E7144
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco Thermo Fisher, Brazil 10270-106
Formaldehyde 37% Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology grade Fisher Scientific, USA BP2618500
L-Glutamine Gibco Thermo Fisher, USA 25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit R&D systems Inc., MN, USA SC006
Nicotinamide Sigma-Aldrich, Germany N0636
Oil Red Stain Sigma-Aldrich, USA O0625
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin Gibco Thermo Fisher, USA 15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg Lonza, Switzerland BE17-516F
Potassium Chloride Fisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA Kit Cloud-Clone Corp., USA CEA682Ra
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific, Germany
Sodium Chloride Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
SYBR Green Maxima Thermo Scientific, USA K0221
Syringe filter, 0.2 micron Corning, USA 431224
TRIzol Thermo Scientific, USA 15596026
Trypan blue Gibco Thermo Fisher, USA 15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1X Lonza, Switzerland CC-5012
Verso cDNA synthesis kit Thermo Scientific, USA AB-1453/A
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Germany M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
  2. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. Haider, K. H. , Springer. Singapore. 1-28 (2022).
  3. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  4. De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
  5. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  6. Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
  7. Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
  8. Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
  9. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  10. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  11. Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
  12. Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
  13. Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
  14. Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  15. Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
  16. Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
  17. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
  18. Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
  19. Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
  20. Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
  21. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
  22. Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
  23. Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
  24. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
  25. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , Hoboken, NJ. 1-12 (2010).
  26. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
  27. Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
  28. Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
  29. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
  30. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
  31. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
  32. Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
  33. Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
  34. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
  35. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
  36. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  37. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
  38. Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 186 תאי גזע תאי גזע מזנכימליים סוכרת תאים המייצרים אינסולין רקמת שומן התמיינות
בידוד של תאי גזע מזנכימליים של רקמת שומן חולדה לצורך התמיינות לתאים המייצרים אינסולין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr,… More

Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells. J. Vis. Exp. (186), e63348, doi:10.3791/63348 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter