تقنية معدلة لاستخدام قلوب الفئران حديثي الولادة في إعداد Langendorff
Summary
يصف هذا البروتوكول القنية الأبهرية والتروية الرجعية لقلب الفئران الوليدي السابق في الجسم الحي . تسمح استراتيجية شخصين ، باستخدام مجهر تشريح وإبرة قياس صغيرة مخففة ، بتعليب موثوق. يتم تحقيق القياس الكمي للتوتر الانقباضي الطولي باستخدام محول طاقة متصل بقمة البطين الأيسر.
Abstract
لطالما كان استخدام القلب الرجعي السابق في الجسم الحي حجر الزاوية في التحقيق في نقص التروية منذ تطويره من قبل أوسكار لانغندورف قبل أكثر من قرن من الزمان. على الرغم من أن هذه التقنية قد تم تطبيقها على الفئران على مدى السنوات ال 25 الماضية ، إلا أن استخدامها في هذا النوع اقتصر على الحيوانات البالغة. ومن شأن تطوير طريقة ناجحة لتعليب الشريان الأورطي الفئراني الوليدي باستمرار أن يسمح بإجراء دراسة منهجية للقلب المعزول الرجعي المنصهر خلال فترة حرجة من تطور القلب في نوع قابل للتعديل وراثيا ومنخفض التكلفة. تعديل إعداد Langendorff يمكن من التعليب وإنشاء التروية في قلب الفئران حديثي الولادة مع تقليل وقت نقص التروية. يتطلب التحسين تقنية من شخصين للسماح بتقليب ناجح للشريان الأورطي للفأر حديث الولادة باستخدام مجهر تشريح وإبرة معدلة متاحة تجاريا. سيؤدي استخدام هذا النهج إلى إنشاء تروية رجعية بشكل موثوق به في غضون 3 دقائق. نظرا لأن هشاشة قلب الفأر الوليدي وحجم تجويف البطين يمنع القياس المباشر للضغط داخل البطين المتولد باستخدام بالون ، فإن استخدام محول طاقة متصل بواسطة خياطة بقمة البطين الأيسر لتحديد التوتر الانقباضي الطولي أمر ضروري. تسمح هذه الطريقة للباحثين بالنجاح في إنشاء إعداد قلب الفئران حديثي الولادة المعزول ذو التدفق المستمر الرجعي ، مما يسمح بدراسة بيولوجيا القلب التنموية بطريقة خارج الجسم الحي . الأهم من ذلك ، سيكون هذا النموذج أداة قوية للتحقيق في الاستجابات الفسيولوجية والدوائية لنقص التروية في قلب حديثي الولادة.
Introduction
كانت مستحضرات القلب خارج الجسم الحي عنصرا أساسيا في الدراسات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية والدوائية لأكثر من قرن. انطلاقا من عمل إلياس سيون في 1860s ، قام أوسكار لانغندورف بتكييف نموذج الضفدع المعزول للتروية الرجعية ، وضغط على جذر الأبهر لتوفير تدفق الشريان التاجي مع عطور مؤكسج1. باستخدام تكيفه ، تمكن Langendorff من إثبات وجود علاقة بين الدورة الدموية التاجية والوظيفة الميكانيكية2. ظل القلب الرجعي السابق في الجسم الحي ، والذي أطلق عليه فيما بعد اسم تقنية Langendorff ، حجر الزاوية في التحقيق الفسيولوجي ، مستفيدا من بساطته لدراسة القلب المعزول بقوة في غياب الارتباك المحتمل. تم تعديل إعداد Langendorff بشكل أكبر للسماح للقلب بالخروج (ما يسمى “القلب العامل”) والسماح للعطر بإعادة تدوير3. ومع ذلك ، ظلت نقاط النهاية الفسيولوجية الأولية للاهتمام دون تغيير. وتشمل نقاط النهاية هذه مقاييس وظيفة الانقباض ، والتوصيل الكهربائي ، والتمثيل الغذائي للقلب ، ومقاومة الشريان التاجي4.
لتقييم وظيفة القلب في إعداد قلب الضفدع الأصلي ، قام لانغندورف بقياس التوتر الناتج عن تقلص البطين في المحور الطولي باستخدام خيط متصل بين قمة القلب ومحول القوة. 5 تم قياس الانقباض متساوي القياس بهذه الطريقة مع تطبيق التوتر القاعدي على القلب في حالة عدم وجود حشوة بطينية. وقد أدى تحسين النهج إلى وضع بالونات مملوءة بالسوائل في البطين الأيسر عبر الأذين الأيسر لتقييم أداء عضلة القلب أثناء الانكماش متساوي الحجم6. لتقييم إيقاع القلب ومعدل ضربات القلب ، يمكن وضع خيوط سطحية على أقطاب القلب لتمكين الباحثين من تسجيل مخطط كهربية القلب. ومع ذلك ، يمكن توقع بطء القلب النسبي ، بالنظر إلى الإلغاء الإلزامي. قد تعمل الوتيرة الخارجية على التغلب على هذا والقضاء على تقلب معدل ضربات القلب بين التجارب1. يمكن تقييم مقياس آخر للنتائج ، وهو استقلاب عضلة القلب ، عن طريق قياس محتوى الأكسجين والركيزة الأيضية في الفوسفات التاجية والنفايات السائلة وحساب الفرق بينهما7. يمكن أن يساعد تحديد كمية اللاكتات في النفايات السائلة التاجية في توصيف فترات التمثيل الغذائي اللاهوائي كما هو موضح مع نقص الأكسجة أو نقص التروية أو نقص التروية أو الاضطرابات الأيضية7.
مكن عمل لانغندورف الأصلي من دراسة قلب الثدييات السابق في الجسم الحي ، باستخدام القطط كموضوع أساسي5. اكتسب تقييم قلب الفئران المعزولة شعبية في منتصف 1900s مع هوارد مورغان ، الذي فصل نموذج الفئران “القلب العامل” في 19675. بدأ استخدام الفئران منذ 25 عاما فقط بسبب التعقيد التقني وهشاشة الأنسجة وحجم قلب الفئران الصغير نسبيا. على الرغم من التحديات المرتبطة بدراسة الفئران ، فإن انخفاض التكاليف وسهولة التلاعب الجيني قد زاد من جاذبية وطلب مستحضرات الفئران خارج الجسم الحي. لسوء الحظ ، اقتصر تطبيق هذه التقنية على الحيوانات البالغة ، حيث كانت الفئران اليافعة البالغة من العمر 4 أسابيع أصغر الأشخاص الذين تم استخدامهم لدراسة الجسم الحي السابق حتى وقت قريب جدا 8,9. في حين أن الفئران الصغيرة “غير ناضجة نسبيا” مقارنة بالبالغين ، إلا أن فائدتها كمواضيع لدراسات البيولوجيا التنموية محدودة لأنها ، إلى حد كبير ، فطمت من سد ولادتها وستبدأ قريبا سن البلوغ10. تحدث المراهقة إلى ما بعد الانتقال بعد الولادة في استخدام ركيزة عضلة القلب من الجلوكوز واللاكتات إلى الأحماض الدهنية11. وبالتالي ، فإن معظم المعلومات حول التغيرات الأيضية في قلب حديثي الولادة قد نتجت تاريخيا عن العمل خارج الجسم الحي في الأنواع الأكبر مثل الأرانب وخنزير غينيا11.
والواقع أن هناك نهجا بديلة لإعداد لانغندورف. وتشمل هذه التجارب في المختبر ، والتي تفتقر إلى البيانات الوظيفية للعضو بأكمله والسياق ، أو في دراسات الجسم الحي. يمكن أن يكون هذا تحديا ومعقدا من الناحية الفنية من خلال متغيرات مربكة مثل الآثار القلبية الوعائية والتنفسية لعامل مخدر مطلوب ، وتأثير المدخلات العصبية الخلطية ، وعواقب درجة الحرارة الأساسية ، والحالة الغذائية للحيوان ، وتوافر الركيزة12,13. نظرا لأن نهج Langendorff يسمح بدراسة القلب المعزول المنصهر بطريقة خارج الجسم الحي بطريقة أكثر تحكما في غياب مثل هذه الإرباكات ، فقد كان ولا يزال يعتبر أداة بحثية قوية. لذلك ، فإن التقنية المعروضة هنا تعطي الباحثين نهجا تجريبيا لدراسة الجسم الحي السابق لقلب الفئران حديث الولادة وتحد من الوقت لإعادة التروية.
يعد فحص القلب خلال فترات التطور أحد الاعتبارات المهمة نظرا للتحولات الكيميائية الحيوية والفسيولوجية والتشريحية واسعة النطاق التي تحدث أثناء نضج عضلة القلب. التحولات من التمثيل الغذائي اللاهوائي إلى الفسفرة التأكسدية ، والتغيرات في استخدام الركيزة ، والتقدم من تكاثر الخلايا إلى التضخم هي عمليات ديناميكية تحدث بشكل فريد في القلب غير الناضج11,14. جانب حاسم آخر من القلب النامي هو أن الضغوطات التي تتم مواجهتها خلال الفترات الضرورية قد تنتج استجابات متزايدة في قلب حديثي الولادة وتغير التعرض المستقبلي للإهانات في مرحلة البلوغ15. على الرغم من أن العمل السابق قد استخدم الفئران والحملان والأرانب حديثي الولادة لدراسة قلب حديثي الولادة الذي يعاني من لانغندورف ، إلا أن التقدم الذي يسمح باستخدام الفئران ضروري نظرا لأهمية هذا النوع في أبحاث البيولوجيا التنموية16. لتلبية هذه الحاجة ، تم مؤخرا إنشاء أول نموذج قلب حديث الولادة من الفئران Langendorff باستخدام عمرها 10 أيام6. تظهر هنا طريقة لتمكين القنية الأبهرية الناجحة وإنشاء تروية رجعية لقلب الفئران حديث الولادة المعزول. يمكن استخدام هذا النهج في علم الأدوية أو نقص التروية أو دراسات التمثيل الغذائي التي تركز على وظيفة العضو بالكامل أو يمكن تكييفه لعزل الخلايا العضلية القلبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا العمل القنية الأبهرية الناجحة والتروية الرجعية في قلب الفأر حديث الولادة المعزول. الأهم من ذلك ، أنه يسمح للباحثين بالتغلب على الحواجز التي قدمها عمر الفئران الصغير وحجم القلب الصغير سابقا8. على الرغم من أن هذا النهج ليس معقدا في التصميم ، إلا أنه يتطلب درجة كبيرة من ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)
Materials
| Rodent Langendorff Apparatus | Radnoti | 130102EZ | |
| 24 G catheter | BD | 381511 | |
| 26 G needle on 1 mL syringe combo | BD | 309597 | |
| 26 G steel needle | BD | 305111 | |
| 5-0 Silk Suture | Ethicon | S1173 | |
| Bio Amp | ADInstruments | FE135 | |
| Bio Cable | ADInstruments | MLA1515 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| Circulating heating water Bath | Haake | DC10 | |
| curved iris scissor | Medline | MDS10033Z | |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| find spring scissors | Kent | INS600127 | |
| Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Heparin | Sagent | 400-01 | |
| High pressure tubing | Edwards Lifesciences | 50P184 | |
| iris dressing forceps | Kent | INS650915-4 | |
| Jeweler-style curved fine forceps | Miltex | 17-307-MLTX | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911-25G | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Roller Pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| straight dissecting scissors | Kent | INS600393-G | |
| Temporary cardiac pacing wire | Ethicon | TPW30 | |
| Wide Range Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/A |
References
- Bell, R., Mocanu, M., Yellon, D. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szeląg, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: Cardiovascular system studies and technological advances. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
- Döring, H. The isolated perfused heart according to Langendorff technique–function–application. Physiologia Bohemoslovaca. 39 (6), 481-504 (1990).
- Liao, R., Podesser, B., Lim, C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: New advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Barajas, M., Yim, P., Gallos, G., Levy, R. An isolated retrograde-perfused newborn mouse heart preparation. MethodsX. 7, 101058 (2020).
- De Leiris, J., Harding, D., Pestre, S. The isolated perfused rat heart: A model for studying myocardial hypoxia or ischaemia. Basic Research in Cardiology. 79 (3), 313-321 (1984).
- Liaw, N., et al. Postnatal shifts in ischemic tolerance and cell survival signaling in murine myocardium. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 305 (10), 1171-1181 (2013).
- Chaudhary, K., et al. Differential effects of soluble epoxide hydrolase inhibition and CYP2J2 overexpression on postischemic cardiac function in aged mice. Prostaglandins and Other Lipid Mediators. 104, 8-17 (2013).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Onay-Besikci, A. Regulation of cardiac energy metabolism in newborn. Molecular and Cellular Biochemistry. 287 (1), 1-11 (2006).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: Advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: A matter of size. Frontiers in Physiology. 3 (345), 00345 (2012).
- Tan, C., Lewandowski, A. The transitional heart: From early embryonic and fetal development to neonatal life. Fetal Diagnosis and Therapy. 47 (5), 373-386 (2020).
- Zhang, P., Lv, J., Li, Y., Zhang, L., Xiao, D. Neonatal lipopolysaccharide exposure gender-dependently increases heart susceptibility to ischemia/reperfusion injury in male rats. International Journal of Medical Sciences. 14 (11), 1163 (2017).
- Ziyatdinova, N., et al. Effect of If Current Blockade on Newborn Rat Heart Isolated According to Langendorff. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 167 (4), 424-427 (2019).
- Teng, B., Tilley, S., Ledent, C., Mustafa, S. In vivo assessment of coronary flow and cardiac function after bolus adenosine injection in adenosine receptor knockout mice. Physiological reports. 4 (11), 12818 (2016).
- Xu, W., et al. Lethal cardiomyopathy in mice lacking transferrin receptor in the heart. Cell Reports. 13 (3), 533-545 (2015).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research. 53 (1), 55-69 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research. ILAR Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blümel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone, ketamine-xylazine, carfentanyl-etomidate). Research in Experimental Medicine. 184 (3), 159-169 (1984).
- Janssen, B., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
- Zuurbier, C., Koeman, A., Houten, S., Hollmann, M., Florijn, W. Optimizing anesthetic regimen for surgery in mice through minimization of hemodynamic, metabolic, and inflammatory perturbations. Experimental Biology and Medicine. 239 (6), 737-746 (2014).
- Hard, G. Thymectomy in the neonatal rat. Laboratory Animals. 9 (2), 105-110 (1975).
- Sun, Z., Ambrosi, E., Bricalli, A., Ielmini, D. Logic computing with stateful neural networks of resistive switches. Advanced Materials. 30 (38), 1802554 (2018).
- Clancy, B., Finlay, B., Darlington, R., Anand, K. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).
- Hornig, M., Chian, D., Lipkin, W. Neurotoxic effects of postnatal thimerosal are mouse strain dependent. Molecular Psychiatry. 9 (9), 833-845 (2004).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 61 (6), 291-332 (1895).
- Edlund, A., Wennmalm, &. #. 1. 9. 7. ;. Oxygen consumption in rabbit Langendorff hearts perfused with a saline medium. Acta Physiologica Scandinavica. 113 (1), 117-122 (1981).
- Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Wengrowski, A., Kay, M. Oxygen demand of perfused heart preparations: How electromechanical function and inadequate oxygenation affect physiology and optical measurements. Experimental Physiology. 100 (6), 603-616 (2015).
- Wiesmann, F., et al. Developmental changes of cardiac function and mass assessed with MRI in neonatal, juvenile, and adult mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 278 (2), 652-657 (2000).
- Le, V., Kovacs, A., Wagenseil, J. Measuring left ventricular pressure in late embryonic and neonatal mice. Journal of visualized experiments. (60), e3756 (2012).
- Bednarczyk, J., et al. Incorporating dynamic assessment of fluid responsiveness into goal-directed therapy: A systematic review and meta-analysis. Critical Care Medicine. 45 (9), 1538 (2017).
- Louch, W., Sheehan, K., Wolska, B. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Ackers-Johnson, M., Foo, R. Langendorff-free isolation and propagation of adult mouse cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. 1940, 193-204 (2019).
- Peng, Y., Buller, C., Charpie, J. Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury. Pediatric Research. 70 (1), 61-66 (2011).
- Jarmakani, J., Nakazawa, M., Nagatomo, T., Langer, G. Effect of hypoxia on mechanical function in the neonatal mammalian heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 235 (5), 469-474 (1978).
- Podesser, B., Hausleithner, V., Wollenek, G., Seitelberger, R., Wolner, E. Langendorff and ischemia in immature and neonatal myocardia: Two essential key-words in Today’s cardiothoracic research. Acta Chirurgica Austriaca. 25 (6), 434-437 (1993).
- Popescu, M., et al. Getting an early start in understanding perinatal asphyxia impact on the cardiovascular system. Frontiers in Pediatrics. 8, 68 (2020).
