Modifierad teknik för användning av neonatala murina hjärtan i Langendorff-preparatet

Summary

Det nuvarande protokollet beskriver aortakannulering och retrograd perfusion av ex-vivo neonatal murinhjärta. En tvåpersonsstrategi, med hjälp av ett dissekerande mikroskop och en trubbig liten mätnål, möjliggör tillförlitlig kannulering. Kvantifiering av längsgående kontraktil spänning uppnås med hjälp av en kraftgivare ansluten till toppen av vänster ventrikel.

Abstract

Användningen av det ex-vivo retrograda perfuserade hjärtat har länge varit en hörnsten i ischemi-reperfusionsutredning sedan dess utveckling av Oskar Langendorff för över ett sekel sedan. Även om denna teknik har tillämpats på möss under de senaste 25 åren, har dess användning i denna art varit begränsad till vuxna djur. Utveckling av en framgångsrik metod för att konsekvent kannulera den neonatala murina aortan skulle möjliggöra en systematisk studie av det isolerade retrograda perfuserade hjärtat under en kritisk period av hjärtutveckling i en genetiskt modifierbar och billig art. Modifiering av Langendorff-preparatet möjliggör kannulering och etablering av reperfusion i det neonatala murina hjärtat samtidigt som ischemisk tid minimeras. Optimering kräver en teknik med två personer för att möjliggöra framgångsrik kannulering av den nyfödda musaortan med hjälp av ett dissekerande mikroskop och en modifierad kommersiellt tillgänglig nål. Användningen av detta tillvägagångssätt kommer på ett tillförlitligt sätt att fastställa retrograd perfusion inom 3 minuter. Eftersom bräckligheten hos det neonatala mushjärtat och ventrikelhålans storlek förhindrar direkt mätning av intraventrikulärt tryck som genereras med hjälp av en ballong, är användning av en kraftgivare ansluten med en sutur till toppen av vänster ventrikel för att kvantifiera längsgående kontraktil spänning nödvändig. Denna metod gör det möjligt för utredare att framgångsrikt etablera ett isolerat retrogradt perfuserat nyfött murinhjärtpreparat med konstant flöde, vilket möjliggör studier av utvecklings hjärtbiologi på ett ex-vivo-sätt . Viktigt är att denna modell kommer att vara ett kraftfullt verktyg för att undersöka de fysiologiska och farmakologiska svaren på ischemi-reperfusion i neonatalhjärtat.

Introduction

Ex-vivo hjärtpreparat har varit en häftklammer i fysiologiska, patofysiologiska och farmakologiska studier i över ett sekel. Oskar Langendorff härrörde från Elias Cyons arbete på 1860-talet och anpassade den isolerade grodmodellen för retrograd perfusion och trycksatte aortaroten för att ge kranskärlsflöde med ett syresatt perfusat¹. Med hjälp av sin anpassning kunde Langendorff visa en korrelation mellan koronarcirkulation och mekanisk funktion². Det ex-vivo retrograda perfuserade hjärtat, senare eponymously kallat Langendorff-tekniken, har förblivit en hörnsten i fysiologisk undersökning och utnyttjat sin enkelhet för att kraftfullt studera det isolerade hjärtat i frånvaro av potentiella confounders. Langendorffpreparatet har modifierats ytterligare för att låta hjärtat spruta ut (det så kallade “arbetshjärtat”) och låta perfusatet återcirkulera³. De primära fysiologiska effektmåtten av intresse har dock varit oförändrade. Sådana slutpunkter inkluderar mått på kontraktil funktion, elektrisk ledning, hjärtmetabolism och koronarresistens⁴.

För att utvärdera hjärtfunktionen i sitt ursprungliga grodhjärtpreparat mätte Langendorff spänningen som genererades av ventrikulär sammandragning i längdaxeln med hjälp av en sutur kopplad mellan hjärtats topp och en kraftgivare. ⁵ Isometrisk sammandragning kvantifierades på detta sätt med basal spänning applicerad på hjärtat i frånvaro av ventrikulär fyllning. Förfining av tillvägagångssättet har lett till vätskefyllda ballonger placerade i vänster kammare via vänster förmak för att utvärdera myokardiell prestanda under isovolumisk sammandragning⁶. För att bedöma hjärtrytmen och hjärtfrekvensen kan ytledningar placeras på hjärtats poler för att göra det möjligt för utredare att registrera elektrokardiogrammet. Relativ bradykardi kan dock förväntas, med tanke på den obligatoriska denervationen. Extrinsisk pacing kan tjäna till att övervinna detta och eliminera hjärtfrekvensvariationen mellan experiment¹. Ett annat utfallsmått, myokardiell metabolism, kan bedömas genom att mäta syre- och metabolisk substrathalt i koronarperfusat och avloppsvatten och beräkna skillnaden mellan dem⁷. Laktatkvantifiering i koronaravloppsvattnet kan hjälpa till att karakterisera perioder av anaerob metabolism som ses med hypoxi, hypoperfusion, ischemi-reperfusion eller metaboliska störningar⁷.

Langendorffs ursprungliga arbete möjliggjorde studier av däggdjurshjärtat ex-vivo, med katter som det primära ämnet⁵. Utvärdering av det isolerade råtthjärtat blev populärt i mitten av 1900-talet hos Howard Morgan, som redogjorde för råttmodellen “arbetshjärta” 1967⁵. Användningen av möss började för bara 25 år sedan på grund av den tekniska komplexiteten, vävnadsbräckligheten och relativt liten murin hjärtstorlek. Trots de utmaningar som är förknippade med mössstudier har de lägre kostnaderna och lättheten för genetisk manipulation ökat överklagandet och efterfrågan på sådana murina ex vivo-preparat. Tyvärr har tillämpningen av tekniken begränsats till vuxna djur, med juvenila 4 veckor gamla möss som de yngsta försökspersonerna som användes för ex-vivo-studier fram till ganska nyligen ^8,9. Medan juvenila möss är “relativt omogna” jämfört med vuxna, är deras användbarhet som ämnen för utvecklingsbiologiska studier begränsad eftersom de i stort sett har avvänt från sin födelsedamm och snart kommer att börja puberteten¹⁰. Tonåren sker långt bortom den postnatala övergången i myokardiellt substratutnyttjande från glukos och laktat till fettsyror¹¹. Således har den mesta informationen om de metaboliska förändringarna i neonatalhjärtat historiskt resulterat från ex-vivo-arbete hos större arter som kaniner och marsvin¹¹.

Det finns faktiskt alternativa tillvägagångssätt för Langendorff-preparatet. Dessa inkluderar in vitro-experiment, som saknar hela organets funktionella data och sammanhang, eller in vivo-studier. Detta kan vara tekniskt utmanande och komplicerat av förvirrande variabler som kardiovaskulära och respiratoriska effekter av ett nödvändigt bedövningsmedel, påverkan av neurohumoral input, konsekvenserna av kärntemperatur, djurets näringsstatus och substrattillgänglighet^12,13. Eftersom Langendorff-metoden tillåter studier av det isolerade perfuserade hjärtat på ett ex-vivo-sätt på ett mer kontrollerat sätt i avsaknad av sådana confounders, har det varit och fortsätter att betraktas som ett kraftfullt undersökningsverktyg. Därför ger tekniken som presenteras här forskare ett experimentellt tillvägagångssätt för ex-vivo-studien av det nyfödda murina hjärtat och begränsar tiden till reperfusion.

Att undersöka hjärtat under utvecklingsperioder är ett viktigt övervägande med tanke på de omfattande biokemiska, fysiologiska och anatomiska övergångar som uppstår under myokardiell mognad. Skiften från anaerob metabolism till oxidativ fosforylering, förändringar i substratutnyttjande och progression från cellproliferation till hypertrofi är dynamiska processer som unikt förekommer i det omogna hjärtat^11,14. En annan kritisk aspekt av det utvecklande hjärtat är att stressfaktorer som uppstår under nödvändiga perioder kan ge ökade svar i det nyfödda hjärtat och förändra framtida mottaglighet för förolämpningar i vuxen ålder¹⁵. Även om tidigare arbete har använt nyfödda råttor, lamm och kaniner för att studera Det Langendorff-perfuserade neonatala hjärtat, är framsteg som tillåter mössanvändning nödvändiga med tanke på denna arts betydelse för utvecklingsbiologisk forskning¹⁶. För att tillgodose detta behov etablerades nyligen den första murina Langendorff-perfuserade nyfödda hjärtmodellen med 10 dagar gamla djur⁶. Här presenteras en metod för att möjliggöra framgångsrik aortakannulering och etablera retrograd perfusion av det isolerade nyfödda murina hjärtat. Detta tillvägagångssätt kan användas för farmakologi, ischemi-reperfusion eller metabolismstudier med fokus på hela organfunktionen eller kan anpassas för isolering av kardiomyocyter.

Protocol

Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University Medical Centers godkännanden erhölls för alla beskrivna metoder. Vildtyp C57Bl/6 hane postnatal dag 10 möss användes för studien. 1. Beredning av Langendorff-apparater För att minimera komplexiteten, använd icke-recirkulerande syresatt perfusat i Langendorff-apparaten (se materialtabell) via konstant flöde eller konstant tryck. Använd Krebs-Henseleit-buffert…

Representative Results

P10-möss användes för att modellera en tidpunkt i människans spädbarn26,27. Femton isolerade C57Bl/6 nyfödda mushjärtan skördades och kannulerades framgångsrikt. Hjärtan perfuserades med ett kontinuerligt flöde på 2,5 ml min-1 av uppvärmd syresatt KHB. Metaboliska parametrar, inklusive glukosextraktion, syreförbrukning, laktatproduktion och fysiologiska parametrar som hjärtfrekvens, perfusionstryck och koronarresistens, mättes. Ytelektr…

Discussion

Det aktuella arbetet beskriver framgångsrik aortakannulering och retrograd perfusion i det isolerade nyfödda mushjärtat. Det är viktigt att det gör det möjligt för forskare att övervinna de hinder som ung murin ålder och liten hjärtstorlek tidigare presenterat⁸. Även om det inte är komplicerat i design, kräver tillvägagångssättet en betydande grad av teknisk skicklighet. Viktiga steg som oundvikligen kommer att utmana även de mest tekniskt skickliga utredarna kommer att vara cannu…

Materials

Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A