Сравнение методов выделения энтомопатогенных грибов из образцов почвы
Summary
Энтомопатогенные грибковые колонии выделяют из образцов тропической почвы с помощью приманки Tenebrio , приманки Galleria , а также селективной искусственной среды, т. е. агара декстрозы картофеля, обогащенного дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом (среда CTC).
Abstract
Целью настоящего исследования является сравнение эффективности использования приманок от насекомых с искусственной селективной средой для выделения энтомопатогенных грибов (EPF) из образцов почвы. Почва является богатой средой обитания для микроорганизмов, в том числе EPF, особенно принадлежащих к родам Metarhizium и Beauveria, которые могут регулировать вредителей членистоногих. Биопрепараты на основе грибов доступны на рынке в основном для борьбы с вредителями сельскохозяйственных членистоногих. Тем не менее, несмотря на высокое эндемичное биоразнообразие, лишь немногие штаммы используются в коммерческих биопродуктах во всем мире. В настоящем исследовании 524 образца почвы были выращены на агаре декстрозы картофеля, обогащенном дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом (среда CTC). Рост колоний грибов наблюдался в течение 3 недель. Все Metarhizium и Beauveria EPF были морфологически идентифицированы на уровне рода. Кроме того, некоторые изоляты были молекулярно идентифицированы на уровне видов. Двадцать четыре из этих 524 образцов почвы были также исследованы на предмет появления EPF с использованием метода приманки для насекомых (Galleria mellonella и Tenebrio molitor). В общей сложности 51 штамм EPF был выделен (41 Metarhizium spp. и 10 Beauveria spp.) из 524 образцов почвы. Все грибковые штаммы были выделены либо из пахотных земель, либо из лугов. Из 24 образцов, отобранных для сравнения, 91,7% были положительными на EPF с использованием приманки Galleria , 62,5% с использованием приманки Tenebrio и 41,7% с использованием CTC. Наши результаты показали, что использование приманок для насекомых для изоляции EPF от почвы более эффективно, чем использование среды CTC. Сравнение методов изоляции в дополнение к идентификации и сохранению EPF оказывает положительное влияние на знания о биоразнообразии. Улучшение коллекции EPF поддерживает научное развитие и технологические инновации.
Introduction
Почва является источником нескольких микроорганизмов, в том числе энтомопатогенных грибов (EPF). Эта конкретная группа грибов признана по их способности колонизировать и часто убивать членистоногих хозяев, особенно насекомых1. После выделения, характеризации, отбора вирулентных штаммов и регистрации EPF массово производятся для борьбы с членистоногими вредителями, что подтверждает их экономическую значимость2. Соответственно, выделение EPF считается первым шагом к разработке биопестицида. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) и Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) являются наиболее распространенными грибами, используемыми для борьбы с членистоногими и вредителями3. EPF были успешно выделены из почвы, членистоногих с видимым микозом, колонизированных растений и растительной ризосферы 4,5.
Выделение EPF также может быть полезно для изучения разнообразия, распространения и экологии этой конкретной группы. В недавней литературе сообщалось, что использование EPF недооценивается, ссылаясь на несколько нетрадиционных применений EPF, таких как их способность улучшать рост растений4, удалять токсичные загрязняющие вещества из почвы и использоваться в медицине6. Настоящее исследование направлено на сравнение эффективности выделения EPF из почвы с использованием приманок насекомых с искусственной питательной средой 7,8,9. Использование Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) в качестве приманки для насекомых в контексте изоляции EPF было хорошо принято. Эти личинки используются во всем мире научным сообществом в качестве экспериментальной модели для изучения взаимодействий хозяин-патоген10,11. Личинка Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) считается еще одной моделью насекомого для исследований, связанных с вирулентностью и выделением EPF, поскольку это насекомое легко редко встречается в лаборатории при низкой стоимости 7,12.
Независимые от культуры методы, такие как использование различных методов ПЦР, могут быть применены для обнаружения и количественной оценки EPF на их субстратах, включая почву13,14. Тем не менее, чтобы правильно изолировать эти колонии грибов, их субстрат следует культивировать на селективной искусственной среде9, или грибы, присутствующие в образцах, могут быть приманены с использованием чувствительных насекомых15. С одной стороны, CTC представляет собой искусственную среду без додина, которая состоит из агара декстрозы картофеля, обогащенного дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом. Эта среда была разработана Fernandes et al. 9 для максимального извлечения естественных Beauveria spp. и Metarhizium spp. из почвы. С другой стороны, личинки G. mellonella и T. molitor также могут быть успешно использованы в качестве приманок для получения изолятов EPF из почвы. Тем не менее, согласно Sharma et al.15, в меньшем количестве исследований сообщалось о сопутствующем использовании и сравнении этих двух насекомых-приманок. На почвах португальских виноградников наблюдалось значительное восстановление Metarhizium robertsii (Metscn.) Сорокин с использованием Т. личинки молитора по сравнению с личинками G. mellonella; напротив, Beauveria bassiana (Балс. -Крив.) Изоляция Vuill была связана с использованием приманок G. mellonella 15. Поэтому решение о том, какой метод изоляции EPF использовать (например, G. mellonella-bait, T. molitor-bait или CTC medium), следует рассматривать в соответствии с целью исследования и лабораторной инфраструктурой. Целью настоящего исследования является сравнение эффективности использования приманок от насекомых с искусственной селективной средой для выделения EPF из образцов почвы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Естественные и сельскохозяйственные почвенные среды обитания являются типичными средами для EPF22 и отличным природным резервуаром. В настоящем исследовании рассматривались два метода изоляции EPF с использованием приманок от насекомых по сравнению с селективной средой. П?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично профинансировано Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) из Бразилии, финансовый код 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (номер проекта E-26/010.001993/2015), и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) из Бразилии.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
