Entomopatojenik mantarları toprak örneklerinden izole etme yöntemlerinin karşılaştırılması
Summary
Entomopatojenik mantar kolonileri, Tenebrio yemi, Galleria yemi ve seçici yapay ortam, yani kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid (CTC ortamı) ile desteklenmiş maya özü ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agarı kullanılarak tropikal toprak örneklerinden izole edilir.
Abstract
Bu çalışmanın amacı, entomopatojenik mantarları (EPF) toprak örneklerinden izole etmek için böcek yemlerinin yapay seçici ortama karşı kullanılmasının etkinliğini karşılaştırmaktır. Toprak, özellikle eklembacaklı zararlılarını düzenleyebilen Metarhizium ve Beauveria cinslerine ait EPF de dahil olmak üzere mikroorganizmalar için zengin bir yaşam alanıdır. Mantarlara dayalı biyolojik ürünler, esas olarak tarımsal eklembacaklı haşere kontrolü için piyasada mevcuttur. Bununla birlikte, yüksek endemik biyoçeşitliliğe rağmen, dünya çapında ticari biyoürünlerde sadece birkaç suş kullanılmaktadır. Bu çalışmada, kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid (CTC ortamı) ile desteklenmiş maya ekstresi ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agar üzerinde 524 toprak örneği kültüre alınmıştır. Mantar kolonilerinin büyümesi 3 hafta boyunca gözlendi. Tüm Metarhizium ve Beauveria EPF, cins düzeyinde morfolojik olarak tanımlanmıştır. Ek olarak, bazı izolatlar tür düzeyinde moleküler olarak tanımlanmıştır. Bu 524 toprak örneğinden yirmi dördü, böcek yemi yöntemi (Galleria mellonella ve Tenebrio molitor) kullanılarak EPF oluşumu için de araştırılmıştır. 524 toprak örneğinden toplam 51 EPF suşu (41 Metarhizium spp. ve 10 Beauveria spp.) izole edildi. Tüm mantar suşları ya ekili alanlardan ya da otlaklardan izole edildi. Karşılaştırma için seçilen 24 numunenin% 91.7’si Galleria yemi kullanan EPF, Tenebrio yemi kullanan% 62.5 ve CTC kullanarak% 41.7’si pozitifti. Sonuçlarımız, EPF’yi topraktan izole etmek için böcek yemlerinin kullanılmasının, CTC ortamını kullanmaktan daha verimli olduğunu göstermiştir. EPF’nin tanımlanması ve korunmasına ek olarak izolasyon yöntemlerinin karşılaştırılması, biyolojik çeşitlilik hakkındaki bilgiler üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir. EPF koleksiyonunun iyileştirilmesi bilimsel gelişmeyi ve teknolojik yeniliği desteklemektedir.
Introduction
Toprak, entomopatojenik mantarlar (EPF) dahil olmak üzere çeşitli mikroorganizmaların kaynağıdır. Bu özel mantar grubu, eklembacaklı konakçıları, özellikle de böceklerikolonileştirme ve sıklıkla öldürme yetenekleriyle tanınır 1. İzolasyon, karakterizasyon, virülan suşların seçimi ve tescilden sonra, EPF, ekonomik alaka düzeylerini destekleyen eklembacaklı-haşere kontrolü için seri olarak üretilir2. Buna göre, EPF’nin izolasyonu, bir biyopestisit gelişiminin ilk adımı olarak kabul edilir. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) ve Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) eklembacaklı-haşere kontrolü için kullanılan en yaygın mantarlardır3. EPF topraktan, görünür mikozlu eklembacaklılardan, kolonize bitkilerden ve bitki rizosferinden başarıyla izole edilmiştir 4,5.
EPF’nin izolasyonu, bu belirli grubun çeşitliliğini, dağılımını ve ekolojisini incelemek için de yararlı olabilir. Son literatür, EPF’nin bitki büyümesini iyileştirmekapasiteleri 4, topraktan toksik kirleticileri uzaklaştırma ve tıpta kullanılma kapasiteleri gibi EPF’nin birkaç geleneksel olmayan uygulamasına atıfta bulunarak EPF kullanımının hafife alındığını bildirmiştir6. Bu çalışma, böcek yemleri kullanarak EPF’yi topraktan izole etmenin verimliliğini yapay kültür ortamı 7,8,9 ile karşılaştırmayı amaçlamaktadır. Galleria mellonella L.’nin (Lepidoptera: Phyralidae) EPF izolasyonu bağlamında bir böcek yemi olarak kullanılması iyi kabul edilmiştir. Bu larvalar dünya çapında bilimsel topluluk tarafından konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için deneysel bir model olarak kullanılmaktadır10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larvası, virülans içeren çalışmalar ve EPF’nin izolasyonu için başka bir böcek modeli olarak kabul edilir, çünkü bu böceğin laboratuvarda düşük maliyetle nadir görülmesi kolaydır 7,12.
Toprak13,14 dahil olmak üzere substratlarındaki EPF’yi tespit etmek ve ölçmek için çeşitli PCR teknikleri kullanmak gibi kültürden bağımsız yöntemler uygulanabilir. Bununla birlikte, bu mantar kolonilerini uygun şekilde izole etmek için, substratları seçici bir yapay ortam9 üzerine kültürlenmelidir veya örneklerde bulunan mantarlar hassas böcekler kullanılarak yemlenebilir15. Bir yandan, CTC, kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid ile desteklenmiş maya özü ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agarından oluşan dodin içermeyen yapay bir ortamdır. Bu ortam Fernandes ve ark. tarafından geliştirilmiştir. 9 Doğal olarak oluşan Beauveria spp. ve Metarhizium spp.’nin topraktan geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak. Öte yandan, G. mellonella ve T. molitor larvaları, topraktan EPF izolatları elde etmek için yem olarak başarıyla kullanılabilir. Bununla birlikte, Sharma ve ark.15’e göre, daha az sayıda çalışma, bu iki yem böceğinin eşzamanlı kullanımını ve karşılaştırmasını bildirmiştir. Portekiz üzüm bağları toprakları, Metarhizium robertsii’nin (Metscn.) önemli geri kazanımlarını sergiledi. T. kullanarak Sorokin molitör larvaları G. mellonella larvalarına kıyasla; Buna karşılık, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill izolasyonu, G. mellonella yemleri15’in kullanımıyla bağlantılıydı. Bu nedenle, hangi EPF izolasyon yönteminin kullanılacağına dair karar (örneğin, G. mellonella-yem, T. molitor-yem veya CTC ortamı) çalışmanın amacına ve laboratuvar altyapısına göre düşünülmelidir. Bu çalışmanın amacı, EPF’yi toprak örneklerinden izole etmek için böcek yemlerinin yapay seçici ortama karşı kullanılmasının etkinliğini karşılaştırmaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doğal ve tarımsal toprak habitatları, EPF22 için tipik ortamlar ve mükemmel bir doğal rezervuardır. Bu çalışmada, böcek yemlerine karşı seçici ortam kullanan iki EPF izolasyon yöntemi ele alınmıştır. İzolasyon için ilk adım, toprak örneklerinin toplanmasıdır. Toprak örneklerinin uygun şekilde depolanması ve tanımlanması çok önemlidir. Enlem, boylam, toprak tipi ve biyom hakkında bilgi, epidemiyolojik, modelleme ve jeo-uzamsal konuları içeren çalışmalar için g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Brezilya’dan Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), finans kodu 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (proje numarası E-26/010.001993/2015) ve Brezilya’dan Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
