Fare Dokularında Kararlı Mikrotübülleri, Labil Mikrotübülleri ve Serbest Tübülleri Ayırmak için Kantitatif Mikrotübül Fraksiyonlama Tekniği
Summary
Tübülin polimerleri olan mikrotübüller, ökaryotik hücrelerde bir hücre iskeleti bileşeni olarak çok önemli bir rol oynar ve dinamik kararsızlıkları ile bilinir. Bu çalışma, çeşitli fare dokularındaki mikrotübüllerin stabilitesini değerlendirmek için mikrotübülleri kararlı mikrotübüllere, kararsız mikrotübüllere ve serbest tübüllere ayırmak için fraksiyonlamak için bir yöntem geliştirdi.
Abstract
α/β-tübülin dimerlerinden oluşan mikrotübüller, ökaryotik hücrelerde hücre iskeletinin çok önemli bir bileşenidir. Bu tüp benzeri polimerler, tübülin heterodimer alt birimleri tekrarlayan polimerizasyon ve depolimerizasyona uğradıkça dinamik kararsızlık sergiler. Tübülin translasyon sonrası modifikasyonlar ve mikrotübül ile ilişkili proteinler yoluyla elde edilen mikrotübül stabilitesinin ve dinamiğinin hassas kontrolü, çeşitli hücresel fonksiyonlar için gereklidir. Mikrotübüllerdeki işlev bozuklukları, nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere patogenezde güçlü bir şekilde rol oynar. Devam eden araştırmalar, stabiliteyi modüle eden ve bu hastalıklar ve kanserler için potansiyel tedavi seçenekleri sunan mikrotübül hedefli terapötik ajanlara odaklanmaktadır. Sonuç olarak, mikrotübüllerin dinamik durumunu anlamak, hastalığın ilerlemesini ve terapötik etkilerini değerlendirmek için çok önemlidir.
Geleneksel olarak, mikrotübül dinamikleri, tübülin sonrası translasyon modifikasyonlarını hedefleyen antikorlar kullanılarak, kaba fraksiyonlama veya immünoassay yoluyla in vitro veya kültürlenmiş hücrelerde değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, bu tür prosedürleri kullanarak dokulardaki tübülin durumunu doğru bir şekilde analiz etmek zorluklar doğurur. Bu çalışmada, fare dokularında stabil mikrotübülleri, kararsız mikrotübülleri ve serbest tübülleri ayırmak için basit ve yenilikçi bir mikrotübül fraksiyonlama yöntemi geliştirdik.
Prosedür, disseke edilmiş fare dokularının 19:1 hacim oranında bir mikrotübül stabilize edici tampon içinde homojenleştirilmesini içeriyordu. Homojenatlar daha sonra, kalıntıları gidermek için ilk yavaş santrifüjlemeyi (2.400 × g) takiben iki aşamalı bir ultrasantrifüj işlemi ile fraksiyonlandı. İlk ultrasantrifüjleme aşaması (100.000 × g) kararlı mikrotübülleri çökeltirken, elde edilen süpernatant, kararsız mikrotübülleri ve çözünür tübülin dimerlerini fraksiyonlamak için ikinci bir ultrasantrifüj adımına (500.000 × g) tabi tutuldu. Bu yöntem, fare beyninde stabil veya kararsız mikrotübüller oluşturan tübülin oranlarını belirledi. Ek olarak, kurucu hücrelerin proliferatif kapasitesi ile ilişkili olan mikrotübül stabilitesinde farklı doku varyasyonları gözlenmiştir. Bu bulgular, fizyolojik ve patolojik koşullarda mikrotübül stabilitesini analiz etmek için bu yeni yöntemin önemli potansiyelini vurgulamaktadır.
Introduction
Mikrotübüller (MT’ler), α/β-tübülin heterodimer alt birimlerinden oluşan protofilamentlerden oluşan uzun tübüler yapılardır. Hücre bölünmesi, hareketlilik, şekil bakımı ve hücre içi taşıma gibi çeşitli hücresel süreçlerde önemli roller oynarlar ve bu da onları ökaryotik hücre iskeletinin ayrılmaz bileşenleri haline getirir1. α-tubulin alt biriminin açığa çıktığı MT’lerin eksi ucu nispeten kararlıyken, β-tübülin alt biriminin açığa çıktığı artı uç, dinamik depolimerizasyon ve polimerizasyonauğrar 2. Dinamik kararsızlık olarak adlandırılan artı uçta bu sürekli tübülin dimer ilavesi ve ayrışma döngüsü, tekrarlayan bir kurtarma ve felaket süreciyle sonuçlanır3. MT’ler, kararlı ve kararsız alanlar dahil olmak üzere dinamik istikrarsızlıkta lokalize varyasyonlara sahip odak alanları sergiler4.
MT’lerin dinamik kararsızlığının hassas kontrolü, özellikle karmaşık morfolojilerle karakterize edilen nöronlarda, çok sayıda hücresel fonksiyon için çok önemlidir. MT’lerin uyarlanabilirliği ve dayanıklılığı, sinir hücrelerinin gelişiminde ve düzgün çalışmasında hayati bir rol oynar 5,6,7. MT’lerin dinamik kararsızlığının, asetilasyon, fosforilasyon, palmitoilasyon, detirozinasyon, delta 2, poliglutamin oksidasyonu ve poliglisilasyon gibi tübülinin çeşitli translasyon sonrası modifikasyonları (PTM’ler) ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Ek olarak, mikrotübül ile ilişkili proteinlerin (MAP’ler) bağlanması, düzenleyici bir mekanizma olarak hizmet eder8. Asetilasyon hariç PTM’ler, ağırlıklı olarak MT’lerin dış yüzeyinde yer alan tübülin karboksi-terminal bölgesinde meydana gelir. Bu modifikasyonlar, MT’ler üzerinde çeşitli yüzey koşulları yaratarak MAP’lerle etkileşimlerini etkiler ve nihayetinde MT kararlılığını yönetir9. α-tübülin içinde bir karboksi-terminal tirozin kalıntısının varlığı, hızlı bir şekilde serbest tübülin havuzu ile değiştirilen dinamik MT’lerin göstergesidir. Tersine, karboksi terminalinin detirozinasyonu ve Lys40’ın asetilasyonu, azaltılmış dinamik kararsızlığa sahip kararlı MT’leri ifade eder 9,10.
Tübülin PTM’leri,MT’lerin 5,7,11,12,13,14,15’in dinamiklerini ve kararlılığını değerlendirmek için deneylerde yaygın olarak kullanılmıştır. Örneğin, hücre kültürü çalışmalarında, tübülinler iki havuza ayrılabilir: serbest tübülin havuzu ve MT havuzu. Bu, kalan MT’leri 15,16,17,18,19 sabitlemeden önce hücre geçirgenliği yoluyla serbest tübülin salınarak elde edilir. Biyokimyasal yöntemler, MT’leri felaketten koruyan, MT’lerin ve serbest tübülinin santrifüjleme yoluyla ayrılmasını sağlayan kimyasal MT stabilizatörlerinin kullanımını içerir20,21,22. Bununla birlikte, bu prosedürler stabil ve daha az stabil (kararsız) MT’ler arasında ayrım yapmaz, bu nedenle beyin gibi dokularda MT’leri veya çözünür tübülini ölçmeyi imkansız hale getirir. Sonuç olarak, fizyolojik ve patolojik koşullar altında organizmalarda MT stabilitesini değerlendirmenin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu deneysel sınırlamayı ele almak için, fare dokusunda MT’leri ve serbest tübülini hassas bir şekilde ayırmak için yeni bir teknik geliştirdik23.
Bu benzersiz MT fraksiyonlama yöntemi, dokularda tübülin durumunu koruyan koşullar altında doku homojenizasyonunu ve kararlı MT’leri, kararsız MT’leri ve serbest tübülini ayırmak için iki aşamalı santrifüjlemeyi içerir. Bu basit prosedür, canlı organizmalarda MT’ler ve MAP’ler üzerine temel araştırmalar, MT stabilitesi ile ilişkili sağlık ve hastalıkların fizyolojik ve patolojik analizleri ve MT’leri hedef alan ilaçlar ve diğer terapötiklerin geliştirilmesi dahil olmak üzere geniş çalışmalara uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canlı organizmalardan alınan dokudaki tübülin durumunu araştırırken en önemli görev, hazırlama sırasında kazara MT polimerizasyonunu veya depolimerizasyonunu önlemektir. Numunelerdeki MT’lerin stabilitesi, MSB’deki Taxol konsantrasyonu, doku miktarının tampona oranı ve doku çıkarmadan homojenizasyon ve santrifüjlemeye kadar olan işlem sırasındaki sıcaklık gibi faktörlerden etkilenir. Bu nedenle, 20 kat homojenat hacmine sahip fare dokusunu analiz etmek için protokolün her adımında koşullar o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen JST tarafından desteklenmiştir: bilim, teknoloji, inovasyonun yaratılmasına yönelik üniversite burslarının kurulması (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), JSPS Üyeleri için Yardım Hibesi (A.HT.; 23KJ2078), Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (B) JSPS KAKENHI (TM için 22H02946), MEXT’ten “Beyin Proteini Yaşlanması ve Demans Kontrolü” başlıklı Yenilikçi Alanlarda Bilimsel Araştırma Hibesi (TM; 26117004) ve Uehara Memorial Foundation’dan (TM; 202020027) Uehara Araştırma Bursu. Yazarlar hiçbir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.
Materials
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| AKTA prime plus | Cytiva | ||
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
- Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
- Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
- Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
- Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
- Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).
- Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
- Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
- Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
- Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
- Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
- Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
- Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
- Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
- Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
- Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
- Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
- Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
- Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
- Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
- Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer’s presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
- Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
- Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer’s disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
- Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer’s disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
- Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
- Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).
