定量微管分离技术分离小鼠组织中稳定的微管、不稳定的微管和游离微管蛋白
Summary
微管是微管蛋白聚合物，在真核细胞中作为细胞骨架成分起着至关重要的作用，并以其动态不稳定性而闻名。本研究开发了一种将微管分离为稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白的方法，以评估微管在各种小鼠组织中的稳定性。
Abstract
微管由α/β-微管蛋白二聚体组成，是真核细胞细胞骨架的重要组成部分。这些管状聚合物表现出动态不稳定性，因为微管蛋白异二聚体亚基会经历重复聚合和解聚。通过微管蛋白翻译后修饰和微管相关蛋白实现微管稳定性和动力学的精确控制，对于各种细胞功能至关重要。微管功能障碍与发病机制密切相关，包括神经退行性疾病。正在进行的研究集中在调节稳定性的微管靶向治疗剂上，为这些疾病和癌症提供了潜在的治疗选择。因此，了解微管的动态状态对于评估疾病进展和治疗效果至关重要。
传统上，微管动力学是通过粗分离或免疫测定在 体外 或培养细胞中评估的，使用靶向微管蛋白翻译后修饰的抗体。然而，使用此类程序准确分析组织中的微管蛋白状态存在挑战。在这项研究中，我们开发了一种简单而创新的微管分离方法，用于分离小鼠组织中的稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白。
该过程涉及以19：1的体积比在微管稳定缓冲液中匀浆解剖的小鼠组织。然后，在初始慢速离心（2,400 × g）之后，通过两步超速离心过程对匀浆进行分馏以除去碎屑。第一个超速离心步骤（100,000 × g）沉淀出稳定的微管，而所得上清液则进行第二个超速离心步骤（500,000 × g）以分馏不稳定的微管和可溶性微管蛋白二聚体。该方法测定了微管蛋白在小鼠大脑中构成稳定或不稳定微管的比例。此外，观察到微管稳定性的明显组织变化与组成细胞的增殖能力相关。这些发现突出了这种新方法在分析生理和病理条件下微管稳定性方面的巨大潜力。
Introduction
微管 （MTs） 是细长的管状结构，由α/β-微管蛋白异二聚体亚基组成的原丝组成。它们在细胞分裂、运动、形状维持和细胞内运输等各种细胞过程中发挥着重要作用，使其成为真核细胞骨架1 的组成部分。暴露α-微管蛋白亚基的 MT 负端相对稳定，而暴露β-微管蛋白亚基的正端经历动态解聚和聚合2。这种微管蛋白二聚体在正端加成和解离的连续循环，称为动态不稳定性，导致重复的救援和灾难过程3.MT 表现出具有动态不稳定性局部变化的焦点域，包括稳定域和不稳定域4。
精确控制MT的动态不稳定性对于许多细胞功能至关重要，特别是在以复杂形态为特征的神经元中。MT 的适应性和耐久性在神经细胞的发育和正常功能中起着至关重要的作用 5,6,7。已发现 MT 的动态不稳定性与微管蛋白的各种翻译后修饰 （PTM） 有关，例如乙酰化、磷酸化、棕榈酰化、去酪氨酸化、δ 2、聚谷氨酰胺氧化和聚甘氨酰化。此外，微管相关蛋白 （MAP） 的结合是一种调节机制8。PTM（不包括乙酰化）主要发生在位于 MT 外表面的微管蛋白羧基末端区域。这些修饰在 MT 上创造了不同的表面条件，影响了它们与 MAP 的相互作用，并最终控制了 MT 的稳定性9。α-微管蛋白中羧基末端酪氨酸残基的存在表明存在动态 MT，其迅速被游离微管蛋白池取代。相反，羧基末端的去酪氨酸化和 Lys40 的乙酰化表明稳定的 MT 具有降低的动态不稳定性 9,10。
微管蛋白的PTM已被广泛用于评估MTs的动力学和稳定性的实验5,7,11,12,13,14,15。例如，在细胞培养研究中，微管蛋白可以分为两个池：游离微管蛋白池和MT池。这是通过在固定剩余的 MT15、16、17、18、19 之前通过细胞通透性释放游离微管蛋白来实现的。生化方法涉及使用化学 MT 稳定剂来保护 MT 免受灾难，从而通过离心分离 MT 和游离微管蛋白20,21,22。然而，这些程序无法区分稳定和不太稳定（不稳定）的 MT，因此无法量化 MT 或大脑等组织中的可溶性微管蛋白。因此，在生理和病理条件下评估生物体的MT稳定性已被证明具有挑战性。为了解决这一实验局限性，我们开发了一种新技术，用于精确分离小鼠组织中的 MT 和游离微管蛋白23。
这种独特的 MT 分离方法涉及在维持组织中微管蛋白状态的条件下进行组织匀浆，以及两步离心以分离稳定的 MT、不稳定的 MT 和游离微管蛋白。这种简单的程序可以应用于广泛的研究，包括生物体中 MT 和 MAP 的基础研究、与 MT 稳定性相关的健康和疾病的生理和病理分析，以及开发靶向 MT 的药物和其他疗法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在研究微管蛋白在活生物体组织中的状态时，最重要的任务是防止制备过程中意外的MT聚合或解聚。从组织去除到匀浆和离心过程中，MTS在样品中的稳定性受MSB中紫杉醇浓度、组织与缓冲液的比例、温度等因素的影响。因此，在用20倍体积的匀浆分析小鼠组织的方案的每个步骤中优化条件。较高浓度的紫杉醇可以在 体外诱导MT聚合，即使在冷却条件下也是如此25。当分析微?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作在一定程度上得到了JST的支持，建立了大学奖学金，以创造科学技术创新（A.HT。JPMJFS2145）、JST SPRING（A.HT.;JPMJSP2129）、JSPS 研究员补助金 （A.HT.; 23KJ2078）、科学研究补助金 （B） JSPS KAKENHI （22H02946 for TM）、文部科学省 （TM; 26117004） 的名为“脑蛋白衰老和痴呆症控制”的创新领域科学研究补助金，以及上原纪念基金会 （TM; 202020027） 的上原研究奖学金。作者声明没有相互竞争的经济利益。
Materials
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| AKTA prime plus | Cytiva | ||
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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