마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하기 위한 정량적 미세소관 분획 기술
Summary
튜불린 중합체인 미세소관은 진핵 세포에서 세포골격 구성 요소로서 중요한 역할을 하며 동적 불안정성으로 알려져 있습니다. 본 연구는 다양한 마우스 조직에서 미세소관의 안정성을 평가하기 위해 미세소관을 분류하여 안정 미세소관, 불안정한 미세소관, 유리 튜불린으로 분리하는 방법을 개발하였다.
Abstract
α/β-튜불린 이량체로 구성된 미세소관은 진핵 세포에서 세포골격의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 튜브형 중합체는 튜불린 헤테로다이머 소단위체가 반복적인 중합 및 해중합을 겪을 때 동적 불안정성을 나타냅니다. 튜불린 번역 후 변형(post-translational modification) 및 미세소관 관련 단백질을 통해 달성되는 미세소관 안정성 및 역학의 정밀한 제어는 다양한 세포 기능에 필수적입니다. 미세소관의 기능 장애는 신경 퇴행성 질환을 포함한 발병기전과 밀접한 관련이 있습니다. 진행 중인 연구는 안정성을 조절하는 미세소관 표적 치료제에 중점을 두고 있으며, 이러한 질병 및 암에 대한 잠재적인 치료 옵션을 제공합니다. 따라서 미세소관의 동적 상태를 이해하는 것은 질병 진행 및 치료 효과를 평가하는 데 매우 중요합니다.
전통적으로 미세소관 역학은 튜불린의 번역 후 변형을 표적으로 하는 항체를 사용하여 거친 분획 또는 면역분석을 통해 시험관 내 또는 배양된 세포에서 평가되었습니다. 그러나 이러한 절차를 사용하여 조직의 튜불린 상태를 정확하게 분석하는 것은 어려운 일입니다. 이 연구에서는 마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하는 간단하고 혁신적인 미세소관 분획 방법을 개발했습니다.
이 절차에는 19:1 부피 비율로 미세소관 안정화 완충액에서 절개된 마우스 조직을 균질화하는 작업이 포함되었습니다. 그런 다음 균질액을 초기 느린 원심분리(2,400× g)에 이어 2단계 초원심분리 공정을 통해 분획하여 파편을 제거했습니다. 제1 초원심분리 단계(100,000 × g)는 안정한 미세소관을 침전시킨 반면, 생성된 상층액은 불안정한 미세소관 및 용해성 튜불린 이량체를 분획하기 위해 제2 초원심분리 단계(500,000 × g)를 거쳤다. 이 방법은 쥐의 뇌에서 안정적이거나 불안정한 미세소관을 구성하는 튜불린의 비율을 측정했습니다. 또한, 구성 세포의 증식 능력과 상관 관계가 있는 미세소관 안정성의 뚜렷한 조직 변이가 관찰되었습니다. 이러한 발견은 생리학적 및 병리학적 조건에서 미세소관 안정성을 분석하기 위한 이 새로운 방법의 상당한 잠재력을 강조합니다.
Introduction
미세소관(MT)은 α/β-튜불린 헤테로다이머 소단위로 구성된 프로토필라멘트로 구성된 길쭉한 관형 구조입니다. 이들은 세포 분열, 운동성, 형태 유지, 세포 내 수송과 같은 다양한 세포 과정에서 필수적인 역할을 하며, 진핵생물 세포골격의 필수 구성 요소가 된다1. α-튜불린 소단위체가 노출되는 MT의 마이너스 엔드는 비교적 안정적인 반면, β-튜불린 서브유닛이 노출되는 플러스 엔드는 동적 해중합 및 중합을 거친다2. 동적 불안정성(dynamic instability)이라고 하는 플러스 말단(plus-end)에서의 튜불린 이량체 첨가 및 해리의 연속적인 순환은 구조와 재앙의 반복적인 과정을 초래한다3. MT는 안정적 영역과 불안정한 영역을 포함하여 동적 불안정성의 국소적 변형이 있는 초점 영역을 나타낸다4.
MT의 동적 불안정성을 정밀하게 제어하는 것은 특히 복잡한 형태를 특징으로 하는 뉴런에서 수많은 세포 기능에 매우 중요합니다. MT의 적응성과 내구성은 신경 세포의 발달과 적절한 기능에 중요한 역할을 합니다 5,6,7. MT의 동적 불안정성은 아세틸화, 인산화, 팔미토일화, 탈티로시닝, 델타 2, 폴리글루타민 산화 및 폴리글리실화와 같은 튜불린의 다양한 번역 후 변형(PTM)과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 또한, 미세소관 관련 단백질(microtubule-associated protein, MAP)의 결합은 조절 메커니즘역할을 한다 8. 아세틸화를 제외한 PTM은 주로 MT의 외부 표면에 위치한 튜불린 카르복시 말단 영역에서 발생합니다. 이러한 수정은 MT에 다양한 표면 조건을 만들어 MAP과의 상호 작용에 영향을 미치고 궁극적으로 MT 안정성을 좌우합니다9. α-튜불린에 카르복시 말단 티로신 잔류물이 존재한다는 것은 동적 MT를 나타내며, 이는 유리 튜불린 풀로 빠르게 대체됩니다. 반대로, 카르복시 말단의 탈티로신화와 Lys40의 아세틸화는 동적 불안정성이 감소된 안정적인 MT를 의미합니다 9,10.
튜불린의 PTM은 MT 5,7,11,12,13,14,15의 역학 및 안정성을 평가하기 위한 실험에 광범위하게 사용되었습니다. 예를 들어, 세포 배양 연구에서 튜불린은 유리 튜불린 풀과 MT 풀의 두 가지 풀로 분리할 수 있습니다. 이는 나머지 MTs 15,16,17,18,19를 고정하기 전에 세포 투과화를 통해 유리 튜불린을 방출함으로써 달성됩니다. 생화학적 방법은 MT를 재앙으로부터 보호하는 화학적 MT 안정제의 사용을 포함하며, 원심분리를 통해 MT와 유리 튜불린의 분리를 가능하게 한다20,21,22. 그러나 이러한 절차는 안정적인 MT와 덜 안정적인(불안정한) MT를 구별하지 못하므로 뇌와 같은 조직에서 MT 또는 용해성 튜불린을 정량화하는 것이 불가능합니다. 결과적으로, 생리학적 및 병리학적 조건에서 유기체의 MT 안정성을 평가하는 것은 어려운 것으로 입증되었습니다. 이러한 실험적 한계를 해결하기 위해 마우스 조직23에서 MT와 유리 튜불린을 정밀하게 분리하는 새로운 기술을 개발했습니다.
이 독특한 MT 분획 방법은 조직에서 튜불린 상태를 유지하는 조건에서의 조직 균질화와 안정적인 MT, 불안정한 MT 및 유리 튜불린을 분리하기 위한 2단계 원심분리를 포함합니다. 이 간단한 절차는 살아있는 유기체의 MT 및 MAP에 대한 기초 연구, MT 안정성과 관련된 건강 및 질병의 생리학적 및 병리학적 분석, MT를 표적으로 하는 약물 및 기타 치료제 개발을 포함한 광범위한 연구에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
살아있는 유기체의 조직 내 튜불린 상태를 조사할 때 가장 중요한 작업은 준비 중 우발적인 MT 중합 또는 해중합을 방지하는 것입니다. 샘플에서 MT의 안정성은 MSB의 탁솔 농도, 완충액에 대한 조직 양의 비율, 조직 제거에서 균질화 및 원심분리에 이르는 과정 중 온도와 같은 요인의 영향을 받습니다. 따라서, 조건은 20배 부피의 균질액으로 마우스 조직을 분석하기 위한 프로토콜의 각 단계에서 최…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 JST의 과학기술 혁신 창출을 위한 대학 펠로우십 설립(A.HT; JPMJFS2145), JST 스프링(A.HT.; JPMJSP2129), JSPS 펠로우를 위한 보조금(A.HT.; 23KJ2078), 과학 연구 보조금(B) JSPS KAKENHI(TM의 경우 22H02946), 문부과학성(TM; 26117004)의 “뇌 단백질 노화 및 치매 제어”라는 제목의 혁신적인 분야에 대한 과학 연구 보조금 및 우에하라 기념 재단(TM; 202020027)의 우에하라 연구 펠로우십. 저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.
Materials
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| AKTA prime plus | Cytiva | ||
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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