Kvantitativ fraksjoneringsteknikk for mikrotubuli for å skille stabile mikrotubuli, labilemikrotubuli og fritt tubulin i musevev

Summary

Mikrotubuli, som er tubulinpolymerer, spiller en avgjørende rolle som cytoskjelettkomponent i eukaryote celler og er kjent for sin dynamiske ustabilitet. Denne studien utviklet en metode for fraksjonering av mikrotubuli for å skille dem i stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og fritt tubulin for å evaluere stabiliteten til mikrotubuli i forskjellige musevev.

Abstract

Mikrotubuli, sammensatt av α/β-tubulindimerer, er en avgjørende komponent i cytoskjelettet i eukaryote celler. Disse rørlignende polymerene utviser dynamisk ustabilitet da tubulinheterodimerunderenheter gjennomgår repeterende polymerisering og depolymerisering. Nøyaktig kontroll av mikrotubuli stabilitet og dynamikk, oppnådd gjennom tubulin posttranslasjonelle modifikasjoner og mikrotubuli-assosierte proteiner, er avgjørende for ulike cellulære funksjoner. Dysfunksjoner i mikrotubuli er sterkt involvert i patogenesen, inkludert nevrodegenerative lidelser. Pågående forskning fokuserer på mikrotubuli-målrettede terapeutiske midler som modulerer stabilitet, og tilbyr potensielle behandlingsalternativer for disse sykdommene og kreftene. Følgelig er forståelse av den dynamiske tilstanden til mikrotubuli avgjørende for å vurdere sykdomsprogresjon og terapeutiske effekter.

Tradisjonelt har mikrotubulidynamikk blitt vurdert in vitro eller i dyrkede celler gjennom grov fraksjonering eller immunoassay, ved bruk av antistoffer rettet mot posttranslasjonelle modifikasjoner av tubulin. Det er imidlertid utfordringer å analysere tubulinstatus i vev nøyaktig ved hjelp av slike prosedyrer. I denne studien utviklet vi en enkel og innovativ fraksjoneringsmetode for mikrotubuli for å skille stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og fritt tubulin i musevev.

Prosedyren involverte homogenisering av dissekerte musevev i en mikrotubuli-stabiliserende buffer ved et volumforhold på 19: 1. Homogenatene ble deretter fraksjonert gjennom en to-trinns ultrasentrifugeringsprosess etter innledende langsom sentrifugering (2,400 × g) for å fjerne rusk. Det første ultrasentrifugeringstrinnet (100 000 × g) utfelte stabile mikrotubuli, mens den resulterende supernatanten ble utsatt for et andre ultrasentrifugeringstrinn (500 000 × g) for å fraksjonere labile mikrotubuli og oppløselige tubulindimerer. Denne metoden bestemte proporsjonene av tubulin som utgjør stabile eller labile mikrotubuli i musehjernen. I tillegg ble det observert forskjellige vevsvariasjoner i mikrotubulistabilitet som korrelerte med den proliferative kapasiteten til bestanddeler. Disse funnene fremhever det betydelige potensialet i denne nye metoden for å analysere mikrotubuli stabilitet i fysiologiske og patologiske forhold.

Introduction

Mikrotubuli (MT) er langstrakte rørformede strukturer som består av protofilamenter bestående av α/β-tubulin heterodimer underenheter. De spiller viktige roller i ulike cellulære prosesser som celledeling, motilitet, formvedlikehold og intracellulær transport, noe som gjør dem til integrerte komponenter i det eukaryote cytoskelettet¹. Minus-enden av MT, hvor α-tubulin-subenheten er eksponert, er relativt stabil, mens plussenden, hvor β-tubulin-underenheten eksponeres, gjennomgår dynamisk depolymerisering og polymerisering². Denne kontinuerlige syklusen av tubulindimeraddisjon og dissosiasjon i plussenden, referert til som dynamisk ustabilitet, resulterer i en repeterende prosess med redning og katastrofe³. MTs viser fokusdomener med lokaliserte variasjoner i dynamisk ustabilitet, inkludert stabile og labile domener⁴.

Nøyaktig kontroll av MTs dynamiske ustabilitet er avgjørende for mange cellulære funksjoner, spesielt i nevroner preget av intrikate morfologier. Tilpasningsevnen og holdbarheten til MTs spiller en viktig rolle i utviklingen og riktig funksjon av nerveceller ^5,6,7. Den dynamiske ustabiliteten til MT har vist seg å være forbundet med forskjellige posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) av tubulin, slik som acetylering, fosforylering, palmitoylering, detyrosinering, delta 2, polyglutaminoksidasjon og polyglyylering. I tillegg fungerer bindingen av mikrotubuli-assosierte proteiner (MAPs) som en reguleringsmekanisme⁸. PTM, unntatt acetylering, forekommer hovedsakelig i det tubulinkarboksyterminale området som ligger på den ytre overflaten av MT. Disse modifikasjonene skaper forskjellige overflateforhold på MT-er, påvirker deres interaksjon med MAP-er og styrer til slutt MT-stabilitet⁹. Tilstedeværelsen av en karboksy-terminal tyrosinrest i α-tubulin indikerer dynamiske MT-er, som raskt erstattes av det frie tubulinbassenget. Omvendt betyr detyrosinering av karboksyterminalen og acetylering av Lys40 stabile MT-er med redusert dynamisk ustabilitet ^9,10.

PTM av tubulin har blitt mye brukt i eksperimenter for å vurdere dynamikken og stabiliteten til MTs 5,7,11,12,13,14,15. For eksempel, i cellekulturstudier, kan tubuliner deles inn i to bassenger: det frie tubulinbassenget og MT-bassenget. Dette oppnås ved å frigjøre fritt tubulin gjennom cellepermeabilisering før fiksering av de resterende MTene 15,16,17,18,19. Biokjemiske metoder innebærer bruk av kjemiske MT-stabilisatorer som beskytter MT mot katastrofe, noe som muliggjør separasjon av MT og fritt tubulin gjennom sentrifugering^20,21,22. Imidlertid skiller disse prosedyrene ikke mellom stabile og mindre stabile (labile) MTs, og gjør det dermed umulig å kvantifisere MTs eller løselig tubulin i vev som hjernen. Følgelig har evaluering av MT-stabilitet i organismer under fysiologiske og patologiske forhold vist seg å være utfordrende. For å løse denne eksperimentelle begrensningen har vi utviklet en ny teknikk for nøyaktig separering av MT og fritt tubulin i musevev²³.

Denne unike MT-fraksjoneringsmetoden involverer vevshomogenisering under forhold som opprettholder tubulinstatus i vev og to-trinns sentrifugering for å skille stabile MT-er, labile MT-er og fritt tubulin. Denne enkle prosedyren kan brukes på brede studier, inkludert grunnleggende forskning på MTs og MAPs i levende organismer, fysiologiske og patologiske analyser av helse og sykdommer forbundet med MT-stabilitet, og utvikling av medisiner og andre terapeutiske midler som retter seg mot MT.

Protocol

1. MT fraksjoneringsmetode MERK: Alle eksperimenter utført i denne studien ble godkjent av Animal Ethics Committee of Doshisha University. C57BL/6J mus av begge kjønn, 3-4 måneder, ble brukt her. I denne protokollen ble dissekerte vev, for eksempel hjerne, lever eller thymus, umiddelbart homogenisert i iskald mikrotubuli stabiliserende buffer (MSB), som inneholdt Taxol (MT-stabilisator) i en konsentrasjon som forhindret ikke bare depolymerisering, men også repolymerisering a…

Representative Results

Kvantifisering av tubulin i P2-, P3- og S3-fraksjonene fra musehjerne ved hjelp av MT-fraksjoneringsmetodenTubulin i musevev ble separert i P2-, P3- og S3-fraksjonene ved MT-fraksjoneringsmetoden og kvantifisert ved vestlig blotting (figur 1A). Bunnfallet av MT som forble i P2-fraksjonen ved ultrasentrifugering ved 100 000 × g i 20 minutter utgjorde 34,86% ± 1,68% av total tubulin i en musehjerne. Supernatanten (S2) ble videre sentrifugert ved 500 000 × g…

Discussion

Den viktigste oppgaven når man undersøker statusen til tubulin i vev fra levende organismer, forhindrer utilsiktet MT-polymerisering eller depolymerisering under fremstilling. Stabiliteten til MT i prøver påvirkes av faktorer som konsentrasjonen av Taxol i MSB, andelen vevsmengde til buffer og temperatur under prosessen fra fjerning av vev til homogenisering og sentrifugering. Derfor ble betingelsene optimalisert i hvert trinn i protokollen for å analysere musevev med et 20 ganger volum homogenat. En høyere konsent…

Materials

1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
AKTA prime plus	Cytiva
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER		AS ONE	HOM
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP		Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman		TOMY
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)		Roche	5056489001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol		LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422