Técnica de fraccionamiento cuantitativo de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón
Summary
Los microtúbulos, que son polímeros de tubulina, desempeñan un papel crucial como componente del citoesqueleto en las células eucariotas y son conocidos por su inestabilidad dinámica. Este estudio desarrolló un método para fraccionar microtúbulos para separarlos en microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre para evaluar la estabilidad de los microtúbulos en varios tejidos de ratón.
Abstract
Los microtúbulos, compuestos por dímeros de α/β-tubulina, son un componente crucial del citoesqueleto de las células eucariotas. Estos polímeros en forma de tubo exhiben inestabilidad dinámica a medida que las subunidades de heterodímero de tubulina se someten a polimerización y despolimerización repetitivas. El control preciso de la estabilidad y la dinámica de los microtúbulos, logrado a través de las modificaciones postraduccionales de la tubulina y las proteínas asociadas a los microtúbulos, es esencial para diversas funciones celulares. Las disfunciones en los microtúbulos están fuertemente implicadas en la patogénesis, incluidos los trastornos neurodegenerativos. La investigación en curso se centra en agentes terapéuticos dirigidos a los microtúbulos que modulan la estabilidad, ofreciendo posibles opciones de tratamiento para estas enfermedades y cánceres. En consecuencia, comprender el estado dinámico de los microtúbulos es crucial para evaluar la progresión de la enfermedad y los efectos terapéuticos.
Tradicionalmente, la dinámica de los microtúbulos se ha evaluado in vitro o en células cultivadas mediante fraccionamiento aproximado o inmunoensayo, utilizando anticuerpos dirigidos a modificaciones postraduccionales de la tubulina. Sin embargo, el análisis preciso del estado de la tubulina en los tejidos mediante estos procedimientos plantea desafíos. En este estudio, desarrollamos un método simple e innovador de fraccionamiento de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón.
El procedimiento consistió en homogeneizar tejidos de ratón disecados en un tampón estabilizador de microtúbulos en una proporción de volumen de 19:1. A continuación, los homogeneizados se fraccionaron mediante un proceso de ultracentrifugación de dos pasos tras una centrifugación lenta inicial (2.400 × g) para eliminar los residuos. La primera etapa de ultracentrifugación (100.000 × g) precipitó microtúbulos estables, mientras que el sobrenadante resultante se sometió a una segunda etapa de ultracentrifugación (500.000 × g) para fraccionar los microtúbulos lábiles y los dímeros de tubulina soluble. Este método determinó las proporciones de tubulina que constituyen microtúbulos estables o lábiles en el cerebro del ratón. Además, se observaron distintas variaciones tisulares en la estabilidad de los microtúbulos que se correlacionaron con la capacidad proliferativa de las células constituyentes. Estos hallazgos ponen de relieve el importante potencial de este novedoso método para analizar la estabilidad de los microtúbulos en condiciones fisiológicas y patológicas.
Introduction
Los microtúbulos (MT) son estructuras tubulares alargadas que comprenden protofilamentos formados por subunidades heterodímeras de α/β-tubulina. Desempeñan un papel esencial en diversos procesos celulares, como la división celular, la motilidad, el mantenimiento de la forma y el transporte intracelular, lo que los convierte en componentes integrales del citoesqueleto eucariota. El extremo negativo de las MT, donde la subunidad de α-tubulina está expuesta, es relativamente estable, mientras que el extremo positivo, donde la subunidad de β-tubulina está expuesta, sufre despolimerización dinámica y polimerización2. Este ciclo continuo de adición y disociación de dímeros de tubulina en el extremo positivo, denominado inestabilidad dinámica, da lugar a un proceso repetitivo de rescate y catástrofe3. Los MT exhiben dominios focales con variaciones localizadas en la inestabilidad dinámica, incluyendo dominios estables y lábiles4.
El control preciso de la inestabilidad dinámica de las MT es crucial para numerosas funciones celulares, particularmente en neuronas caracterizadas por morfologías intrincadas. La adaptabilidad y durabilidad de las MT juegan un papel vital en el desarrollo y buen funcionamiento de las células nerviosas 5,6,7. Se ha encontrado que la inestabilidad dinámica de los MT está asociada con varias modificaciones postraduccionales (PTM) de la tubulina, como acetilación, fosforilación, palmitoilación, destirosinación, delta 2, oxidación de poliglutamina y poliglicación. Además, la unión de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP) sirve como mecanismo regulador8. Los PTM, excluyendo la acetilación, se producen predominantemente en la región carboxiterminal de la tubulina situada en la superficie externa de los MT. Estas modificaciones crean diversas condiciones superficiales en los MT, lo que influye en su interacción con los MAP y, en última instancia, gobierna la estabilidad del MT9. La presencia de un residuo de tirosina carboxiterminal en la α-tubulina es indicativa de MT dinámicos, que son rápidamente reemplazados por el pool de tubulina libre. Por el contrario, la destirosinación del extremo carboxilo y la acetilación de Lys40 significan MTs estables con inestabilidad dinámica reducida 9,10.
Los PTM de la tubulina se han empleado ampliamente en experimentos para evaluar la dinámica y la estabilidad de las MT 5,7,11,12,13,14,15. Por ejemplo, en los estudios de cultivos celulares, las tubulinas se pueden segregar en dos grupos: el grupo de tubulinas libres y el grupo MT. Esto se logra liberando tubulina libre a través de la permeabilización celular antes de fijar los MT restantes 15,16,17,18,19. Los métodos bioquímicos implican el uso de estabilizadores químicos de MT que protegen a las MT de catástrofes, permitiendo la separación de MTs y tubulina libre a través de la centrifugación20,21,22. Sin embargo, estos procedimientos no diferencian entre MT estables y menos estables (lábiles), lo que hace imposible cuantificar MT o tubulina soluble en tejidos como el cerebro. En consecuencia, la evaluación de la estabilidad de la MT en organismos en condiciones fisiológicas y patológicas ha demostrado ser un desafío. Para abordar esta limitación experimental, hemos desarrollado una técnica novedosa para separar con precisión las MT y la tubulina libre en tejido de ratón23.
Este método único de fraccionamiento de MT implica la homogeneización de los tejidos en condiciones que mantienen el estado de la tubulina en los tejidos y la centrifugación en dos pasos para separar las MT estables, las MT lábiles y la tubulina libre. Este sencillo procedimiento puede aplicarse a estudios amplios, como la investigación básica sobre las MT y las MAP en organismos vivos, los análisis fisiológicos y patológicos de la salud y las enfermedades asociadas a la estabilidad de la MT, y el desarrollo de fármacos y otras terapias dirigidas a las MT.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tarea más importante cuando se investiga el estado de la tubulina en el tejido de los organismos vivos es prevenir la polimerización o despolimerización accidental de la MT durante la preparación. La estabilidad de los MT en las muestras se ve afectada por factores como la concentración de Taxol en MSB, la proporción de cantidad de tejido a tampón y la temperatura durante el proceso desde la extracción del tejido hasta la homogeneización y centrifugación. Por lo tanto, se optimizaron las condiciones en cada …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por JST, el establecimiento de becas universitarias para la creación de innovación científica y tecnológica (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), una subvención para becarios de JSPS (A.HT.; 23KJ2078), una subvención para la investigación científica (B) JSPS KAKENHI (22H02946 para TM), una subvención para la investigación científica en áreas innovadoras titulada “Envejecimiento de las proteínas cerebrales y control de la demencia” del MEXT (TM; 26117004), y por la beca de investigación Uehara de la Fundación Uehara Memorial (TM; 202020027). Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Materials
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| AKTA prime plus | Cytiva | ||
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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