Kvantitativ mikrotubulifraktioneringsteknik för att separera stabila mikrotubuli, labila mikrotubuli och fritt tubulin i musvävnader

Summary

Mikrotubuli, som är tubulinpolymerer, spelar en avgörande roll som en cytoskelettkomponent i eukaryota celler och är kända för sin dynamiska instabilitet. Denna studie utvecklade en metod för fraktionering av mikrotubuli för att separera dem i stabila mikrotubuli, labila mikrotubuli och fria tubuli för att utvärdera stabiliteten hos mikrotubuli i olika musvävnader.

Abstract

Mikrotubuli, som består av α/β-tubulindimerer, är en avgörande komponent i cytoskelettet i eukaryota celler. Dessa rörliknande polymerer uppvisar dynamisk instabilitet när tubulinheterodimersubenheter genomgår repetitiv polymerisation och depolymerisation. Exakt kontroll av mikrotubulistabilitet och dynamik, uppnådd genom tubulin posttranslationella modifieringar och mikrotubuliassocierade proteiner, är avgörande för olika cellulära funktioner. Dysfunktioner i mikrotubuli är starkt inblandade i patogenes, inklusive neurodegenerativa sjukdomar. Pågående forskning fokuserar på mikrotubuliriktade terapeutiska medel som modulerar stabiliteten, vilket erbjuder potentiella behandlingsalternativ för dessa sjukdomar och cancerformer. Att förstå mikrotubulis dynamiska tillstånd är därför avgörande för att bedöma sjukdomsprogression och terapeutiska effekter.

Traditionellt har mikrotubulidynamiken utvärderats in vitro eller i odlade celler genom grov fraktionering eller immunanalys, med hjälp av antikroppar riktade mot posttranslationella modifieringar av tubulin. Att noggrant analysera tubulinstatus i vävnader med hjälp av sådana procedurer innebär dock utmaningar. I denna studie utvecklade vi en enkel och innovativ mikrotubulifraktioneringsmetod för att separera stabila mikrotubuli, labila mikrotubuli och fritt tubuli i musvävnader.

Proceduren innebar homogenisering av dissekerade musvävnader i en mikrotubulistabiliserande buffert med ett volymförhållande på 19:1. Homogenaten fraktionerades sedan genom en ultracentrifugeringsprocess i två steg efter en inledande långsam centrifugering (2 400 × g) för att avlägsna skräp. Det första ultracentrifugeringssteget (100 000 × g) fällde ut stabila mikrotubuli, medan den resulterande supernatanten utsattes för ett andra ultracentrifugeringssteg (500 000 × g) för att fraktionera labila mikrotubuli och lösliga tubulindimerer. Denna metod bestämde proportionerna av tubulin som utgör stabila eller labila mikrotubuli i mushjärnan. Dessutom observerades distinkta vävnadsvariationer i mikrotubulistabilitet som korrelerade med den proliferativa kapaciteten hos de ingående cellerna. Dessa fynd belyser den betydande potentialen hos denna nya metod för att analysera mikrotubulistabilitet vid fysiologiska och patologiska tillstånd.

Introduction

Mikrotubuli (MT) är långsträckta rörformiga strukturer som består av protofilament bestående av α/β-tubulinheterodimerunderenheter. De spelar viktiga roller i olika cellulära processer såsom celldelning, motilitet, formunderhåll och intracellulär transport, vilket gör dem till integrerade komponenter i det eukaryota cytoskelettet¹. Minus-änden av MTs, där α-tubulin-subenheten är exponerad, är relativt stabil, medan plus-end, där β-tubulin-subenheten är exponerad, genomgår dynamisk depolymerisation och polymerisation². Denna kontinuerliga cykel av tubulindimertillsats och dissociation i plusänden, kallad dynamisk instabilitet, resulterar i en repetitiv räddnings- och katastrofprocess³. MT:er uppvisar fokala domäner med lokaliserade variationer i dynamisk instabilitet, inklusive stabila och labila domäner⁴.

Exakt kontroll av den dynamiska instabiliteten hos MT är avgörande för många cellulära funktioner, särskilt i neuroner som kännetecknas av intrikata morfologier. MT:s anpassningsförmåga och hållbarhet spelar en viktig roll för nervcellernas utveckling och funktion ^5,6,7. Den dynamiska instabiliteten hos MT har visat sig vara associerad med olika posttranslationella modifieringar (PTM) av tubulin, såsom acetylering, fosforylering, palmitoylering, detyrosinering, delta 2, polyglutaminoxidation och polyglylyylering. Dessutom fungerar bindningen av mikrotubuliassocierade proteiner (MAP) som en regleringsmekanism⁸. PTM, med undantag för acetylering, förekommer främst i den tubulinkarboxiterminala regionen som är belägen på den yttre ytan av MT. Dessa modifieringar skapar olika ytförhållanden på MT:er, vilket påverkar deras interaktion med MAPs och i slutändan styr MT-stabiliteten⁹. Förekomsten av en karboxiterminal tyrosinrest i α-tubulin tyder på dynamiska MTs, som snabbt ersätts av den fria tubulinpoolen. Omvänt innebär detyronisering av karboxiterminalen och acetylering av Lys40 stabila MT med minskad dynamisk instabilitet ^9,10.

PTM av tubulin har använts i stor utsträckning i experiment för att bedöma dynamiken och stabiliteten hos MTs 5,7,11,12,13,14,15. Till exempel, i cellodlingsstudier, kan tubuliner delas upp i två pooler: den fria tubuliinpoolen och MT-poolen. Detta uppnås genom att frigöra fritt tubulin genom cellpermeabilisering innan de återstående MT fixeras 15,16,17,18,19. Biokemiska metoder innebär användning av kemiska MT-stabilisatorer som skyddar MT från katastrof, vilket möjliggör separation av MT och fritt tubulin genom centrifugering^20,21,22. Dessa procedurer skiljer dock inte mellan stabila och mindre stabila (labila) MTs, vilket gör det omöjligt att kvantifiera MTs eller lösligt tubulin i vävnader som hjärnan. Följaktligen har det visat sig vara en utmaning att utvärdera MT-stabilitet hos organismer under fysiologiska och patologiska förhållanden. För att ta itu med denna experimentella begränsning har vi utvecklat en ny teknik för att exakt separera MT och fritt tubulin i musvävnad²³.

Denna unika MT-fraktioneringsmetod involverar vävnadshomogenisering under förhållanden som bibehåller tubulinstatus i vävnader och tvåstegscentrifugering för att separera stabila MTs, labila MTs och fritt tubulin. Denna enkla procedur kan tillämpas på breda studier, inklusive grundforskning om MT och MAPs i levande organismer, fysiologiska och patologiska analyser av hälsa och sjukdomar som är förknippade med MT-stabilitet, och utveckling av läkemedel och andra terapier som riktar sig mot MT.

Protocol

1. Metod för fraktionering av maskinton OBS: Alla experiment som utförts i denna studie har godkänts av djuretikkommittén vid Doshisha University. C57BL/6J-möss av båda könen, 3-4 månader gamla, användes här. I detta protokoll homogeniserades dissekerade vävnader, t.ex. hjärna, lever eller bräss, omedelbart i iskall mikrotubulistabiliserande buffert (MSB), som innehöll Taxol (MT-stabilisator) i en koncentration som förhindrade inte bara depolymerisation utan även…

Representative Results

Kvantifiering av tubulin i P2-, P3- och S3-fraktionerna från mushjärna med MT-fraktioneringsmetodenTubulin i musvävnad separerades i P2-, P3- och S3-fraktioner med MT-fraktioneringsmetoden och kvantifierades med Western blotting (figur 1A). Utfällningen av MTs som stannade kvar i P2-fraktionen genom ultracentrifugering vid 100 000 × g i 20 minuter stod för 34,86 % ± 1,68 % av det totala tubulinet i en mushjärna. Supernatanten (S2) centrifugerades ytterli…

Discussion

Den viktigaste uppgiften när man undersöker statusen för tubulin i vävnad från levande organismer är att förhindra oavsiktlig MT-polymerisation eller depolymerisation under beredningen. Stabiliteten hos MT i prover påverkas av faktorer som koncentrationen av Taxol i MSB, andelen vävnadsmängd i buffert och temperatur under processen från vävnadsavlägsnande till homogenisering och centrifugering. Därför optimerades förhållandena i varje steg av protokollet för analys av musvävnad med en 20-faldig volym h…

Materials

1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
AKTA prime plus	Cytiva
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER		AS ONE	HOM
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP		Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman		TOMY
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)		Roche	5056489001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol		LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422