Her præsenteres en metode til analyse af proteinaggregeringskinetik i nematoden Caenorhabditis elegans. Dyr fra en alderssynkroniseret population afbildes på forskellige tidspunkter, efterfulgt af semiautomatiseret inklusionstælling i CellProfiler og tilpasning til en matematisk model i AmyloFit.
Proteinaggregering i uopløselige indeslutninger er et kendetegn for en række menneskelige sygdomme, hvoraf mange er aldersrelaterede. Nematoden Caenorhabditis elegans er en veletableret modelorganisme, der er blevet anvendt i vid udstrækning på området til at studere proteinaggregering og toksicitet. Dens optiske gennemsigtighed muliggør direkte visualisering af proteinaggregering ved fluorescensmikroskopi. Desuden gør den hurtige reproduktive cyklus og korte levetid nematoden til en passende model til at screene for gener og molekyler, der modulerer denne proces.
Kvantificeringen af den samlede belastning hos levende dyr er imidlertid dårligt standardiseret, typisk udført ved manuel inklusionstælling under et fluorescensdissektionsmikroskop på et enkelt tidspunkt. Denne tilgang kan resultere i stor variation mellem observatører og begrænser forståelsen af aggregeringsprocessen. I modsætning hertil overvåges amyloidlignende proteinaggregering in vitro rutinemæssigt af thioflavin T-fluorescens på en meget kvantitativ og tidsopløst måde.
Her præsenteres en analog metode til den upartiske analyse af aggregeringskinetik i levende C. elegans ved hjælp af et konfokalmikroskop med høj gennemstrømning kombineret med skræddersyet billedanalyse og datatilpasning. Anvendeligheden af denne metode demonstreres ved at overvåge inklusionsdannelsen af et fluorescerende mærket polyglutamin (polyQ) protein i kropsvæggens muskelceller. Billedanalysearbejdsgangen gør det muligt at bestemme antallet af indeslutninger på forskellige tidspunkter, som er tilpasset en matematisk model baseret på uafhængige nukleationshændelser i individuelle muskelceller. Den metode, der er beskrevet her, kan vise sig nyttig til at vurdere virkningerne af proteostasefaktorer og potentielle terapeutiske lægemidler til proteinaggregeringssygdomme hos et levende dyr på en robust og kvantitativ måde.
Akkumuleringen af misfoldede proteiner i uopløselige aflejringer forekommer i en lang række sygdomme. Velkendte eksempler er aggregeringen af amyloid-β og tau i Alzheimers sygdom, α-synuclein i Parkinsons sygdom og huntingtin med udvidet polyQ ved Huntingtons Sygdom 1,2. Misfoldningen af disse polypeptider i amyloidfibriller er forbundet med toksicitet og celledød ved mekanismer, der stadig stort set er uklare. Belysning af mekanismerne for amyloiddannelse vil være afgørende for at udvikle effektive terapier, som i øjeblikket ikke er tilgængelige.
Detaljerede undersøgelser af amyloiddannelse er blevet udført in vitro baseret på thioflavin T-fluorescensmålinger, hvilket har ført til en mekanistisk forståelse af aggregeringsprocessen og effekten af hæmmende molekyler 3,4,5. Det er imidlertid ikke klart, om de samme aggregeringsmekanismer gælder i det komplekse miljø af levende celler og organismer. Nematodeormen Caenorhabditis elegans er en egnet modelorganisme til at studere proteinaggregering in vivo. Det har en relativt simpel anatomi, men består af flere væv, herunder muskler, tarm og et nervesystem. Det er genetisk velkarakterieret, og værktøjer til genetisk modifikation er let tilgængelige. Desuden har den en kort generationstid på ~ 3 dage og en samlet levetid på 2-3 uger. Som sådan kan proteinaggregering undersøges i hele dyrets levetid på en eksperimentelt bekvem tidsskala. Endelig er nematoden optisk gennemsigtig, hvilket gør det muligt at spore aggregeringen af fluorescerende mærkede proteiner i levende dyr.
Disse egenskaber ved C. elegans er tidligere blevet udnyttet til at undersøge aggregeringen af polyQ-proteiner som en model for Huntingtons Sygdom og andre polyQ-ekspansionssygdomme. Over den patogene tærskel på 35-40 glutaminrester kan polyQ-proteinerne mærket med gult fluorescerende protein (YFP) observeres for at danne uopløselige indeslutninger i muskelvævet 6,7, neuroner8 og tarmen 9,10. Disse funktioner er blevet brugt i vid udstrækning til at screene for gener 11,12,13 og småmolekylemodifikatorer 14 af proteinaggregering og toksicitet.
C. elegans har potentiale til at spille en vigtig rolle i at bygge bro mellem in vitro-studier af proteinaggregering og mere komplekse sygdomsmodeller som mus15. C. elegans kan anvendes til lægemiddelscreening16 , men kan også udnyttes til at opnå en grundlæggende forståelse af de molekylære mekanismer for proteinaggregering in vivo, som det for nylig blev påvist17. For begge anvendelser er det imidlertid af største betydning at udtrække et kvantitativt og reproducerbart mål for proteinaggregering. Her opnås dette ved hjælp af et konfokalmikroskop med høj gennemstrømning kombineret med en dedikeret billedanalysepipeline (figur 1).
Metoden, der præsenteres heri, letter en upartisk og kvantitativ analyse af proteinaggregeringskinetik i modelorganismen C. elegans. Det afhænger af fire nøgleelementer (figur 1): 1) opretholdelse af en alderssynkroniseringspopulation af nematoder; 2) fluorescensmikroskopi i flerbrøndsplader; 3) automatiseret inklusionstælling i CellProfiler; 4) datatilpasning i AmyloFit. Sammenlignet med manuel optælling af indeslutninger i frit bevægelige dyr eller fra gemte billeder26 er kvantificering i CellProfiler både hurtigere og mere upartisk. Den anden vigtige udvikling af protokollen er erhvervelsen af kinetiske data, snarere end enkelte tidspunkter, som giver kvantitativ indsigt i aggregeringsmekanismen ved tilpasning af dataene til en matematisk model.
De fire elementer i protokollen kan bruges som uafhængige moduler, der kan ændres afhængigt af applikationen. Alderssynkroniserede populationer kan også opretholdes ved hjælp af 5-fluor-2′-deoxyuridin (FUDR) til sterilisering af dyrene. Denne forbindelse påvirker levetiden og proteostase 24,25 og er meget kræftfremkaldende for eksperimentatoren; Det udelukker dog manuel overførsel af ormene, som kan være arbejdskrævende, når et stort antal håndteres. Andre alternativer er brugen af sterile mutanter29 eller filtreringsanordninger til at adskille afkom30.
Fluorescensmikroskopitrinnet kan også justeres, for eksempel ved hjælp af højere forstørrelser til at overvåge proteinaggregering i neuroner. Widefield-mikroskopi kan være tilstrækkelig til at overvåge polyQ-aggregering i muskelceller, når den relative forskel mellem betingelserne er vigtigere end det absolutte antal indeslutninger. CellProfiler-rørledningen kan stadig bruges i disse tilfælde, selvom indstillingerne til at genkende orme og indeslutninger skal justeres af brugeren. Teknikkens gennemstrømning er i øjeblikket begrænset af behovet for manuel plukning af dyrene i 384-brøndspladen. Dette kan potentielt afhjælpes ved brug af mikrofluidiske enheder16. Natriumazid er et relativt hårdt bedøvelsesmiddel, som kan erstattes af fysisk immobilisering med hydrogeler eller perler28,29.
Analysen i AmyloFit præsenteret her er baseret på en aggregeringsmekanisme bestående af uafhængige nukleationshændelser i individuelle celler. I tilfælde, hvor denne model ikke passer, bør brugeren overveje et alternativ såsom den kooperative aggregeringsmodel, der er udviklet tidligere17. En begrænsning af denne tilgang er, at stammer, der udtrykker proteinet af interesse i forskellige koncentrationer, skal være tilgængelige, selv om disse kan genereres ved hjælp af rutinemæssige C. elegans metoder24.
Alt i alt giver denne protokol mulighed for at opnå data af høj kvalitet for proteinaggregeringskinetik i et in vivo-modelsystem , hvilket giver mulighed for detaljeret analyse af aggregeringsmekanismer17. Selvom metoden blev demonstreret for polyQ-aggregering i C. elegans muskelvæv, kan fremtidige anvendelser af protokollen omfatte andre proteiner og væv og virkningerne af proteostasefaktorer og små molekyler.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Morimoto-laboratoriet for C. elegans-stammer og Esmeralda Bosman for hjælp til det konfokale mikroskop med høj gennemstrømning. Dette arbejde blev finansieret af et opstartstilskud fra Utrecht Universitet til T.S.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |