Här presenteras en metod för analys av proteinaggregeringskinetik i nematoden Caenorhabditis elegans. Djur från en ålderssynkronerad population avbildas vid olika tidpunkter, följt av halvautomatisk inkluderingsräkning i CellProfiler och anpassning till en matematisk modell i AmyloFit.
Proteinaggregering i olösliga inneslutningar är ett kännetecken för en mängd olika mänskliga sjukdomar, varav många är åldersrelaterade. Nematoden Caenorhabditis elegans är en väletablerad modellorganism som har använts i stor utsträckning inom området för att studera proteinaggregering och toxicitet. Dess optiska transparens möjliggör direkt visualisering av proteinaggregering genom fluorescensmikroskopi. Dessutom gör den snabba reproduktionscykeln och den korta livslängden nematoden till en lämplig modell för att screena för gener och molekyler som modulerar denna process.
Kvantifieringen av aggregerad belastning hos levande djur är emellertid dåligt standardiserad, vanligtvis utförd genom manuell inkluderingsräkning under ett fluorescensdissektionsmikroskop vid en enda tidpunkt. Den här metoden kan resultera i stor variation mellan observatörer och begränsar förståelsen för aggregeringsprocessen. Däremot övervakas amyloidliknande proteinaggregering in vitro rutinmässigt av tioflavin T-fluorescens på ett mycket kvantitativt och tidsupplöst sätt.
Här presenteras en analog metod för opartisk analys av aggregeringskinetik i levande C. elegans, med hjälp av ett konfokalmikroskop med hög genomströmning kombinerat med skräddarsydd bildanalys och dataanpassning. Tillämpligheten av denna metod demonstreras genom övervakning av inklusionsbildning av ett fluorescerande märkt polyglutamin (polyQ) protein i kroppens väggmuskelceller. Arbetsflödet för bildanalys gör det möjligt att bestämma antalet inneslutningar vid olika tidpunkter, som är anpassade till en matematisk modell baserad på oberoende kärnbildningshändelser i enskilda muskelceller. Den metod som beskrivs här kan visa sig vara användbar för att bedöma effekterna av proteostasfaktorer och potentiella behandlingar för proteinaggregeringssjukdomar hos ett levande djur på ett robust och kvantitativt sätt.
Uppsamlingen av felveckade proteiner i olösliga avlagringar sker i ett brett spektrum av sjukdomar. Välkända exempel är aggregeringen av amyloid-β och tau vid Alzheimers sjukdom, α-synuklein vid Parkinsons sjukdom och huntingtin med expanderad polyQ vid Huntingtons sjukdom 1,2. Felveckningen av dessa polypeptider till amyloidfibriller är associerad med toxicitet och celldöd av mekanismer som fortfarande till stor del är oklara. Att belysa mekanismerna för amyloidbildning kommer att vara avgörande för att utveckla effektiva terapier, som för närvarande inte är tillgängliga.
Detaljerade undersökningar av amyloidbildning har utförts in vitro baserat på tioflavin T-fluorescensmätningar, vilket leder till en mekanistisk förståelse av aggregeringsprocessen och effekten av hämmande molekyler 3,4,5. Det är emellertid inte klart om samma aggregeringsmekanismer gäller i den komplexa miljön hos levande celler och organismer. Nematodmasken Caenorhabditis elegans är en lämplig modellorganism för att studera proteinaggregering in vivo. Den har en relativt enkel anatomi men består av flera vävnader, inklusive muskler, tarmar och ett nervsystem. Det är genetiskt väl karakteriserat, och verktyg för genetisk modifiering är lättillgängliga. Dessutom har den en kort generationstid på ~ 3 dagar och en total livslängd på 2-3 veckor. Som sådan kan proteinaggregering undersökas över djurets livslängd på en experimentellt lämplig tidsskala. Slutligen är nematoden optiskt transparent, vilket möjliggör spårning av aggregeringen av fluorescerande märkta proteiner i levande djur.
Dessa egenskaper hos C. elegans har tidigare utnyttjats för att undersöka aggregeringen av polyQ-proteiner som en modell för Huntingtons och andra polyQ-expansionssjukdomar. Över det patogena tröskelvärdet på 35-40 glutaminrester kan polyQ-proteinerna märkta med gult fluorescerande protein (YFP) observeras för att bilda olösliga inneslutningar i muskelvävnaden 6,7, neuroner8 och tarmen 9,10. Dessa egenskaper har använts i stor utsträckning för att screena för gener 11,12,13 och småmolekylära modifierare14 av proteinaggregering och toxicitet.
C. elegans har potential att spela en viktig roll för att överbrygga klyftan mellan in vitro-studier av proteinaggregering och mer komplexa sjukdomsmodeller som möss15. C. elegans är mottaglig för läkemedelsscreening16 men kan också utnyttjas för att få en grundläggande förståelse för de molekylära mekanismerna för proteinaggregering in vivo, vilket nyligen visades17. För båda tillämpningarna är det dock av största vikt att extrahera ett kvantitativt och reproducerbart mått på proteinaggregering. Här uppnås detta med hjälp av ett konfokalmikroskop med hög genomströmning i kombination med en dedikerad bildanalyspipeline (figur 1).
Metoden som presenteras här underlättar en opartisk och kvantitativ analys av proteinaggregeringskinetiken i modellorganismen C. elegans. Det beror på fyra nyckelelement (figur 1): 1) upprätthålla en ålderssynkroniserad population av nematoder; 2) fluorescensmikroskopi i multiwellplattor; 3) automatiserad inkluderingsräkning i CellProfiler; 4) datapassning i AmyloFit. Jämfört med manuell räkning av inneslutningar i fritt rörliga djur eller från sparade bilder26 är kvantifieringen i CellProfiler både snabbare och mer opartisk. Den andra viktiga utvecklingen av protokollet är förvärvet av kinetiska data, snarare än enskilda tidpunkter, vilket ger kvantitativa insikter i aggregeringsmekanismen vid anpassning av data till en matematisk modell.
De fyra elementen i protokollet kan användas som oberoende moduler som kan ändras beroende på applikation. Ålderssynkroniserade populationer kan också upprätthållas med hjälp av 5-fluor-2′-deoxyuridin (FUDR) för att sterilisera djuren. Denna förening påverkar livslängden och proteostasen24,25 och är mycket cancerframkallande för experimenteraren; Det utesluter dock manuell överföring av maskarna, vilket kan vara arbetsintensivt när stora antal hanteras. Andra alternativ är användning av sterila mutanter29 eller filtreringsanordningar för att separera avkommor30.
Fluorescensmikroskopisteget kan också justeras, till exempel med hjälp av högre förstoringar för att övervaka proteinaggregering i neuroner. Widefield-mikroskopi kan vara tillräcklig för att övervaka polyQ-aggregering i muskelceller när den relativa skillnaden mellan tillstånd är viktigare än det absoluta antalet inneslutningar. CellProfiler-pipelinen kan fortfarande användas i dessa fall, även om inställningarna för att känna igen maskar och inneslutningar måste justeras av användaren. Teknikens genomströmning begränsas för närvarande av behovet av manuell plockning av djuren i 384-brunnsplattan. Detta kan eventuellt åtgärdas genom användning av mikrofluidiska anordningar16. Natriumazid är ett relativt hårt bedövningsmedel, som kan ersättas med fysisk immobilisering med hydrogeler eller pärlor28,29.
Analysen i AmyloFit som presenteras här är baserad på en aggregeringsmekanism bestående av oberoende kärnbildningshändelser i enskilda celler. I de fall där denna modell inte passar bör användaren överväga ett alternativ, t.ex. den kooperativa aggregeringsmodell som utvecklats tidigare17. En begränsning av detta tillvägagångssätt är att stammar som uttrycker proteinet av intresse vid olika koncentrationer måste vara tillgängliga, även om dessa kan genereras med hjälp av rutinmässiga C. elegans-metoder 24.
Sammantaget ger detta protokoll möjlighet att erhålla högkvalitativa data för proteinaggregeringskinetik i ett in vivo-modellsystem , vilket möjliggör detaljerad analys av aggregeringsmekanismer17. Även om metoden demonstrerades för polyQ-aggregering i C. elegans muskelvävnad, kan framtida tillämpningar av protokollet innefatta andra proteiner och vävnader och effekterna av proteostasfaktorer och små molekyler.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Morimoto-laboratoriet för C. elegans-stammar och Esmeralda Bosman för hjälp med konfokalmikroskopet med hög genomströmning. Detta arbete finansierades av ett startbidrag från Utrecht University till T.S.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |