Primer, Malign Plevral Mezotelyoma Tümör Hatlarının Oluşumu ve Genleşmesi
Summary
Bu yöntem makalesinin amacı, cerrahi olarak rezeke edilmiş plevral mezotelyomadan primer tümör hücre hatlarının zenginleştirilmesi, üretilmesi ve genişletilmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir metodoloji göstermektir.
Abstract
Nadir tümör tiplerinden primer tümör hücre hatlarının genişlemesi için mevcut metodolojiler eksiktir. Bu protokol, primer tümör hücrelerini cerrahi olarak rezeke edilmiş, malign plevral mezotelyomadan (MPM) genişletme yöntemlerini açıklayarak, sindirimden zenginleştirmeye, genişlemeye, kriyoprezervasyona ve fenotipik karakterizasyona kadar olan sürece tam bir genel bakış sağlar. Ek olarak, bu protokol, diferansiyel tripsinizasyon ve ayrışma yöntemlerinin fenotipik karakterizasyon için hücre yüzey belirteçlerinin tespiti üzerindeki etkisi gibi çoklu tümör tipleri için yararlı olabilecek tümör üretimi için kavramlar sunmaktadır. Bu çalışmanın en büyük sınırlaması, iki boyutlu (2D) bir kültür sisteminde genişleyecek tümör hücrelerinin seçimidir. Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri, medya takviyeleri, yapışmayı iyileştirmek için plaka kaplama ve alternatif ayrışma yöntemleri de dahil olmak üzere bu protokoldeki varyasyonlar, bu tekniği ve bir tümör hattı oluşturmanın genel başarı oranını artırabilir. Genel olarak, bu protokol bu nadir tümörden tümör hücrelerinin oluşturulması ve karakterize edilmesi için temel bir yöntem sağlar.
Introduction
Malign plevral mezotelyoma (MPM), asbest maruziyeti ile yüksek oranda ilişkili nadir bir tümördür. İmmünoterapiye dayalı yaklaşımlar cesaret verici sonuçlar göstermesine rağmen, bu hastalığı geliştiren hastalar için mevcut tedavi seçeneklerinin yetersizliği vardır ve genel 5 yıllık sağkalım oranı düşüktür 1,2. Bu hastalığı daha iyi anlamak ve hasta sonuçlarını iyileştirebilecek yeni terapötik hedefler belirlemek için birçok kurumda çabalar devam etmektedir. Birden fazla mezotelyoma fare modeli olsa da, primer mezotelyoma tümör hücrelerine erişim daha sınırlıdır3. Primer mezotelyoma tümör hücrelerinin in vitro genişlemesi, tümör hücrelerini doğrudan incelemek ve tümör infiltrasyonu yapan lenfositler gibi otolog immün hücrelerle etkileşimlerini incelemek için kullanılabilecek değerli bir model sistemi sağlayacaktır. Primer mezotelyoma tümör hücreleri hatlarının genişlemesi hakkında raporlar bulunmakla birlikte, bunlar azdır ve ayrıntılı bir standart operasyon prosedürü (SOP) sağlamamaktadır. Ayrıca, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) gibi ticari kaynaklardan birkaç hücre hattı mevcuttur. Primer tümör hatlarının mevcudiyeti sınırlı olmakla birlikte, tümör hücrelerinin plevral efüzyonlardan ve doğrudan tümör dokusundan genişletilebileceği gösterilmiştir 4,5. Ek olarak, genişlemiş tümör hücre hatlarının orijinal tümörün moleküler profilini koruduğu gösterilmiştir 4,5,6.
Laboratuvarımız MPM’nin tümör-immün mikroçevresini incelemekte ve cerrahi olarak rezeke edilen vakalardan primer MPM tümör hücreleri hatlarını genişletmek için bir yöntem geliştirmiştir. Bu yöntem, primer metastatik melanom tümör hücre hatlarının oluşturulmasındaki deneyimlerimizden uyarlanmıştır. Bu çalışmanın amacı, bir 2D model sistemi ve ardından fenotipik profilleme kullanarak primer mezotelyoma tümör hattı genişlemesine ayrıntılı ve pratik bir yaklaşım sağlamaktır. İlk basamak ayar2’de CTLA4 ve PD-1’i hedef alan kontrol noktası blokaj stratejilerinin son zamanlardaki başarısı göz önüne alındığında, birçok primer tümör hattı üretme yeteneği, hem tümörün içsel direnç mekanizmalarının anlaşılmasını daha da ileri götürebilir hem de T hücresi tanımayı değerlendirmek için önemli bir model sistemi sağlayabilir, böylece MPM’deki immün yanıt hakkındaki anlayışımızı derinleştirebilir.
Bu protokolün en büyük sınırlaması, her tümörün farklı bir mikro çevre içermesi ve genişleme başarısının yüksek derecede değişkenliğinin olmasıdır. Ek olarak, bu yöntem bir 2D kültür sisteminde genişleyebilen tümör hücrelerini seçer. Bir 3D sferoid veya organoid kültürünün üretimini içeren diğer yöntemler, daha yüksek bir genişleme başarı oranına izin verebilecek veya geleneksel bir 2D sistemde genişleyemeyen hücre çizgilerini türetme yeteneği ile sonuçlanabilecek alternatif bir yaklaşım sağlayabilir. Bu tür 3D kültürlerin, örneğin pankreas kanseri7 gibi genişlemesi zor olan tümör tiplerinin üretimi için yararlı olduğu gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol basit olsa da, yakından takip edilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Erken pasaj dondurma, başlangıçta başarısız olursa tümör hücresi zenginleştirme işlemini tekrarlama yeteneğini korumak için önemlidir. Doğru bölünme ve ortam açlığı tekniğine karar vermek için fibroblastik kontaminasyonu gözle değerlendirme yeteneği, kültürde fibroblast aşırı büyümesini önlemek için hayati öneme sahiptir. Ek olarak, diferansiyel tripsinizasyon yöntemi, inkübasyon sırasında hü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raquel Laza-Briviesca’ya bu protokolün başlatılmasına katkılarından ve Dr. Boris Sepesi, Reza Mehran ve David Rice’a doku koleksiyonları konusundaki işbirliğinden dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışmayla ilgili ek bir finansman yoktur.
Materials
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A. Preclinical models of malignant mesothelioma. Frontiers in Oncology. 10, 101 (2020).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
