Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

Summary

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Abstract

Der Membranproteintransport reguliert den Einbau und die Entfernung von Rezeptoren und Ionenkanälen in die Plasmamembran. Dieser Prozess ist grundlegend wichtig für die Zellfunktion und die Zellintegrität von Neuronen. Drosophila-Photorezeptorzellen sind zu einem Modell für die Untersuchung des Membranproteintransports geworden. Neben Rhodopsin, das bei Beleuchtung aus der Photorezeptormembran internalisiert und abgebaut wird, weist der transiente Rezeptorpotential-ähnliche (TRPL) Ionenkanal in Drosophila eine lichtabhängige Translokation zwischen der rhabdomeralen Photorezeptormembran (wo es sich im Dunkeln befindet) und dem Photorezeptorzellkörper (zu dem es bei Beleuchtung transportiert wird) auf. Dieser intrazelluläre Transport von TRPL kann auf einfache und nicht-invasive Weise untersucht werden, indem eGFP-markiertes TRPL in Photorezeptorzellen exprimiert wird. Die eGFP-Fluoreszenz kann dann entweder in der tiefen Pseudopupille oder mittels Wasserimmersionsmikroskopie beobachtet werden. Diese Methoden ermöglichen den Nachweis der Fluoreszenz im intakten Auge und sind daher nützlich für Hochdurchsatz-Assays und genetische Screens für Drosophila-Mutanten , die bei der TRPL-Translokation defekt sind. Hier werden die Herstellung von Fliegen, die mikroskopischen Techniken sowie Quantifizierungsmethoden, mit denen diese lichtgetriggerte Translokation von TRPL untersucht wird, ausführlich erläutert. Diese Methoden können auch für Handelsstudien an anderen Drosophila-Photorezeptorproteinen , zum Beispiel Rhodopsin, angewendet werden. Darüber hinaus können diese Methoden durch die Verwendung von eGFP-markierten rhabdomeralen Proteinen verwendet werden, um die Degeneration von Photorezeptorzellen zu beurteilen.

Introduction

Durch die Abgabe und Entfernung von Proteinen zur und von der Plasmamembran steuert der Membranproteintransport in Neuronen die Plasmamembranausrüstung mit Rezeptoren sowie Ionenkanälen und reguliert dadurch die neuronale Funktion. Fehlregulationen oder Defekte im Proteintransport haben typischerweise schädliche Auswirkungen auf Zellen und führen zu neuronaler Degeneration. Beim Menschen kann dies neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson oder Retinitis pigmentosa¹ verursachen. Photorezeptoren im Facettenauge von Drosophila melanogaster sind zu einem In-vivo-Modellsystem für die Untersuchung des Membranproteintransports^{geworden 2}. Dies liegt nicht nur an der genetischen Vielseitigkeit von Drosophila , die effektive genetische Screens ermöglicht, sondern auch daran, dass alle wesentlichen Bestandteile der lichtabsorbierenden Photorezeptormembran sehr detailliert charakterisiert sind und effiziente mikroskopische Techniken zur Verfügung stehen, die auf das Fliegenauge angewendet werden können. Diese Techniken stehen im Mittelpunkt dieses Artikels.

In Drosophila-Photorezeptorzellen bildet die apikale Plasmamembran einen dicht gepackten Stapel von Mikrovilli entlang einer Seite der Zelle, der als Rhabdomere bezeichnet wird. Die Rhabdomere der Photorezeptorzellen R1-6 sind in einem charakteristischen trapezförmigen Muster angeordnet, während die Photorezeptorzellen R7 und R8 ein einzelnes Rhabdomere in der Mitte dieses^{Trapezes 3} bilden. Der Membranproteintransport wird für einen regulierten Umsatz von rhabdomeralen Membranproteinen wie Rhodopsin und den lichtaktivierten Ionenkanälen TRP (transient receptor potential) und TRPL (TRP-like) benötigt, um die richtige Menge dieser Phototransduktionsproteine im Rhabdomere sicherzustellen. Photorezeptormembranproteine werden im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert und über den Golgi-Apparat zum Rhabdomere transportiert. Nach der Aktivierung von Rhodopsin durch Licht kann ein Rhodopsinmolekül entweder durch Absorption eines zweiten Photons inaktiviert oder durch Clathrin-vermittelte Endozytose aus dem Rhabdomere entfernt werden. Endozytosiertes Rhodopsin wird entweder im Lysosom abgebaut oder in den Rhabdomere^{zurückgeführt 4,5}. Der Ionenkanal TRPL wird nach Aktivierung der Phototransduktionskaskade ebenfalls internalisiert und durchläuft eine lichtabhängige Translokation zwischen dem Rhabdomere (wo er sich befindet, wenn Fliegen im Dunkeln gehalten werden) und einem ER-angereicherten Staufach im Zellkörper (zu dem er bei Beleuchtung innerhalb weniger Stunden transportiert wird)^6,7,8,9,10 . Im Gegensatz zu endozytosiertem Rhodopsin werden nur geringe Mengen TRPL über den endolysosomalen Weg abgebaut, und der Großteil wird stattdessen intrazellulär gespeichert und bei dunkler Anpassung wieder in den Rhabdomer zurückgeführt⁶. TRPL kann somit zur Analyse des lichtgetriggerten Transports von Plasmamembranproteinen verwendet werden. Drosophila-Photorezeptorzellen werden auch zur Untersuchung der neuronalen Degeneration eingesetzt. Die Degeneration von Photorezeptorzellen wird häufig durch die Beurteilung der Struktur von Rhabdomeren bestimmt, die infolge degenerativer Prozesse zerfallen⁵.

Um die subzelluläre Lokalisation von TRPL und Rhodopsin in Photorezeptorzellen oder die Degeneration von Photorezeptorzellen zu untersuchen, wurden hier zwei Fluoreszenzmikroskopie-Methoden angewendet, die sich hinsichtlich Analysegeschwindigkeit und Auflösung unterscheiden. Eine sehr schnelle, nicht-invasive Methode, die für genetische Screens verwendet werden kann, jedoch mit einer begrenzten räumlichen Auflösung, ist der Nachweis der Fluoreszenz in der tiefen Pseudopupille (DPP). Das DPP ist ein optisches Phänomen von Arthropoden-Facettenaugen, dessen geometrischer Ursprung¹⁹⁷¹ von Franceschini und Kirschfeld ausführlich erklärt wurde 11. Kurz gesagt, auf mehreren optischen Ebenen unterhalb der Netzhautüberlagerung können Bilder von Rhabdomeren aus benachbarten Ommatidien beobachtet werden. Auf einer Fokusebene durch die Mitte der Augenkrümmung bilden diese überlagerten Projektionen ein Bild, das dem trapezförmigen Layout von Rhabdomeren in einem einzigen Ommatidium ähnelt, das nur um Größenordnungen größer ist. Dieses Phänomen kann auch unabhängig von der exogenen Expression von Fluoreszenzproteinen (z.B. TRPL::^{EGFP 8}) beobachtet werden, was den Nachweis des DPP jedoch erleichtert (Abbildung 1A-A‘‘)¹². Eine zweite nicht-invasive Methode ist die Wasserimmersionsmikroskopie, die auf der Abbildung fluoreszierend markierter Proteine beruht, nachdem der Dioptrienapparat der Augen optisch mit Wasser neutralisiert wurde (Abbildung 1B-C‘‘)¹². Mit der Wasserimmersionsmethode kann die relative Menge an TRPL::eGFP in den Rhabdomeren oder im Zellkörper für einzelne Photorezeptorzellen quantitativ beurteilt werden. Darüber hinaus können nicht-translozierende fluoreszenzmarkierte Proteine verwendet werden, um die rhabdomerale Integrität zu bewerten und den zeitlichen Verlauf einer möglichen Degeneration quantitativ zu bestimmen, wie hier beschrieben.

Während Aufzeichnungen des DPP bei weitem die einfachste und schnellste dieser Methoden sind, ist die räumliche Auflösung der von ihnen generierten Daten begrenzt. Darüber hinaus gibt es zahlreiche Gründe, warum ein DPP fehlen kann, die für die DPP-Bildgebung selbst nicht unbedingt erkennbar sind. Da der DPP eine Summe mehrerer Ommatidien darstellt, gehen Informationen über einzelne Zellen verloren. Daher erfüllt die DPP-Bildgebung mit niedriger Auflösung eine wichtige Funktion beim Screening einer großen Anzahl von Fliegen, sollte jedoch im Allgemeinen von Aufnahmen mit höherer Auflösung mittels Wasserimmersionsmikroskopie gefolgt werden. Wasserimmersionsmikroskope erlauben Interpretationen über einzelne Zellen, Entwicklungsdefekte, Augenmorphologie, Proteinfehllokalisation oder Netzhautdegeneration sowie die Quantifizierung dieser Effekte. Dieses Protokoll beschreibt diese beiden Techniken im Detail.

Abbildung 1: Übersicht über die in diesem Protokoll dargestellten Mikroskopievariationen für das Drosophila-Auge. Schematische Darstellungen und exemplarische Mikroaufnahmen der (A-A”) fluoreszierenden tiefen Pseudopupillenbildgebung (DPP), (B-B”) der tödlichen Wasserimmersionsmikroskopie von fluoreszierenden Rhabdomeren und (C-C‘‘) der nicht-tödlichen Wassertropfenmikroskopie von fluoreszierenden Rhabdomeren. Maßstabsleiste (A”): 100 μm. Maßstabsstäbe (B”–C‘‘): 10 μm Die Abbildung wurde gegenüber Referenz¹³ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

1. Allgemeine Erwägungen Verwenden Sie Drosophila-Bestände , die ein dauerhaft rhabdomeral lokalisiertes Fluoreszenzprotein exprimieren, für morphologische Analysen (z. B. TRP::EGFP, EGFP::NINAC) und translozierende Proteine für Analysen bezüglich Proteintransports (z. B. TRPL::EGFP, ARR2::eGFP). Bestimmen Sie die Lichtexpositionsbedingungen ausgewählter Fliegen für den experimentellen Ansatz vor. Zur Dunkelanpassung die Fliegen für den gewünschten Zeitraum b…

Representative Results

Transgene Drosophila-Fliegen, die ein TRPL::eGFP-Fusionsprotein unter der Kontrolle des Rhodopsin-1-Promotors exprimieren, wurden erzeugt. Bei diesen Fliegen wird TRPL::eGFP in den Photorezeptorzellen R1-6 des Facettenauges exprimiert und zeigt eine beleuchtungsabhängige Lokalisation. Wenn Fliegen im Dunkeln gehalten werden, wird TRPL::eGFP in die äußeren Rhabdomere eingearbeitet. Nach mehrstündiger Beleuchtung transloziert TRPL in den Zellkörper, wo es in einem ER-angereicherten Kompartiment gespeichert wi…

Discussion

Die Anwendbarkeit von Fluoreszenzproteinen und die Einfachheit des Screenings durch DPP-Bildgebung und retinale Wasserimmersionsmikroskopie haben sich in vielen Gruppen¹² als erfolgreich erwiesen. Ähnliche Strategien wie die hier vorgestellten wurden in mehreren genetischen Screens verwendet, um Defekte in der Rhodopsinexpression, Homöostase, Netzhautorganisation oder zellulären Integrität mit Hilfe von Rh1::eGFP^{17,18,19,20,21</su…}

Materials

15 mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188271
CO2 anaesthesia fly pad	Flystuff	59-172
Cold light lamp (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss
Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2]	Osram	4050300518039
Laboratory pipette (20-200 µL)	Eppendorf
Object slide	Roth	0656.1
Petri dish (94 mm)	Greiner Bio-One	633102
Pipette tips (200 µL)	Labsolute	7695844
Plasticine (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Stereo microscope (SMZ445)	Nikon
Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica