Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии
Summary
Здесь представлен анализ восстановления in vitro на основе микроскопии TIRF для одновременной количественной оценки и сравнения динамики двух популяций микротрубочек. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких микротрубочек-ассоциированных белков на сшитых пучках микротрубочек и одиночных микротрубочек.
Abstract
Микротрубочки представляют собой полимеры гетеродимеров αβ-тубулина, которые организуются в различные структуры в клетках. Архитектуры и сети на основе микротрубочек часто содержат подмножества массивов микротрубочек, которые различаются по своим динамическим свойствам. Например, в делящихся клетках стабильные пучки сшитых микротрубочек сосуществуют в непосредственной близости от динамических несшитых микротрубочек. Исследования восстановления in vitro на основе TIRF-микроскопии позволяют одновременно визуализировать динамику этих различных массивов микротрубочек. В этом анализе камера визуализации собирается с поверхностно-иммобилизованными микротрубочками, которые либо присутствуют в виде одиночных нитей, либо организованы в сшитые пучки. Введение тубулина, нуклеотидов и белковых регуляторов позволяет непосредственно визуализировать ассоциированные белки и динамические свойства одиночных и сшитых микротрубочек. Кроме того, изменения, которые происходят, когда динамические одиночные микротрубочки организуются в пучки, могут отслеживаться в режиме реального времени. Описанный здесь способ позволяет проводить систематическую оценку активности и локализации отдельных белков, а также синергетических эффектов белковых регуляторов на два разных подмножества микротрубочек в идентичных экспериментальных условиях, тем самым обеспечивая механистические идеи, недоступные другим методам.
Introduction
Микротрубочки представляют собой биополимеры, которые образуют структурные каркасы, необходимые для нескольких клеточных процессов, начиная от внутриклеточного транспорта и позиционирования органелл до деления и удлинения клеток. Для выполнения этих разнообразных функций отдельные микротрубочки организованы в массивы размером с микрон, такие как митотические веретена, цилиарные аксонемы, пучки нейронов, межфазные массивы и растительные корковые массивы. Вездесущим архитектурным мотивом, найденным в этих структурах, является пучок микротрубочек, сшитых по их длине1. Интригующей особенностью нескольких структур на основе микротрубочек является сосуществование пучковых микротрубочек и несшитых одиночных микротрубочек в непосредственной пространственной близости. Эти субпопуляции микротрубочек могут демонстрировать резко отличающуюся динамику полимеризации друг от друга, как это необходимо для их правильного функционирования2,3,4,5. Например, внутри митотического шпинделя стабильные сшитые пучки и динамические одиночные микротрубочки присутствуют в микронной области в центре ячейки6. Таким образом, изучение того, как определяются динамические свойства сосуществующих популяций микротрубочек, имеет решающее значение для понимания сборки и функции структур на основе микротрубочек.
Микротрубочки представляют собой динамические полимеры, которые циклически переключаются между фазами полимеризации и деполимеризации, переключаясь между двумя фазами в событиях, известных как катастрофа и спасение7. Динамика клеточных микротрубочек регулируется мириадами микротрубочек,ассоциированных белков (MAP), которые модулируют скорость полимеризации и деполимеризации микротрубочек и частоты катастроф и спасательных событий. Исследовать активность MAP на пространственно проксимальных массивах в клетках сложно из-за ограничений пространственного разрешения в световой микроскопии, особенно в областях с высокой плотностью микротрубочек. Более того, наличие нескольких MAP в одной и той же клеточной области затрудняет интерпретацию клеточных биологических исследований. Анализы восстановления in vitro, выполняемые в сочетании с микроскопией полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF), обходят проблемы изучения механизмов, с помощью которых конкретные подмножества MAP регулируют динамику проксимальных клеточных микротрубочек. Здесь исследуется динамика собранных in vitro микротрубочек в присутствии одного или нескольких рекомбинантных MAP в контролируемых условиях8,9,10. Однако обычные анализы восстановления обычно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива, что исключает визуализацию сосуществующих популяций.
Здесь мы представляем анализы восстановления in vitro , которые позволяют одновременно визуализировать две популяции микротрубочек в одних и тех же условиях решения11. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких MAP на одиночных микротрубочках и на пучках микротрубочек, сшитых митотическим веретенно-ассоциированным белком PRC1. Белок PRC1 преимущественно связывается при перекрытии между антипараллельными микротрубочками, сшивая их9. Вкратце, этот протокол состоит из следующих этапов: (i) подготовка исходных растворов и реагентов, (ii) очистка и обработка поверхности покровных пластин, используемых для создания камеры визуализации для микроскопических экспериментов, (iii) подготовка стабильных «семян» микротрубочек, из которых полимеризация инициируется в ходе эксперимента, (iv) спецификация настроек микроскопа TIRF для визуализации динамики микротрубочек, (v) иммобилизация семян микротрубочек и генерация сшитых пучков микротрубочек в камере визуализации и (vi) визуализация динамики микротрубочек в камере визуализации с помощью микроскопии TIRF при добавлении растворимого тубулина, MAP и нуклеотидов. Эти анализы позволяют качественно оценить и количественно изучить локализацию MAP и их влияние на динамику двух популяций микротрубочек. Кроме того, они облегчают оценку синергетического воздействия нескольких MAP на эти популяции микротрубочек в широком диапазоне экспериментальных условий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь эксперимент значительно расширяет сферу применения и сложность обычных анализов восстановления микротрубочек, которые традиционно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива. Текущий анализ обеспечивает метод одновременной количественной оце…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NIH (No 1DP2GM126894-01), а также средствами Pew Charitable Trusts и Smith Family Foundation для R.S. Авторы благодарят доктора Шуо Цзяна за его вклад в разработку и оптимизацию протоколов.
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
References
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
- Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
- Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
- Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
- Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
- Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
- Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
- Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
- Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).
