TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化
Summary
ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ 再構成アッセイを提示し、2つの微小管集団のダイナミクスを同時に定量および比較する。架橋された微小管束および単一の微小管上の複数の微小管関連タンパク質の集合的活性を同時に見る方法が記載されている。
Abstract
微小管は、細胞内で別個の構造に組織化するαβ-チューブリンヘテロ二量体のポリマーである。微小管ベースのアーキテクチャとネットワークには、多くの場合、動的特性が異なる微小管アレイのサブセットが含まれています。例えば、細胞を分裂させる際に、架橋微小管の安定な束は、動的非架橋微小管のすぐ近くに共存する。TIRF顕微鏡ベースの インビトロ 再構成研究は、これらの異なる微小管アレイのダイナミクスの同時可視化を可能にする。このアッセイでは、イメージングチャンバは、単一のフィラメントとして存在するか、または架橋束に組織化された表面固定化微小管で組み立てられる。チューブリン、ヌクレオチド、およびタンパク質調節剤の導入により、関連するタンパク質の直接可視化、および単一および架橋微小管の動的特性の直接可視化が可能になります。さらに、動的な単一の微小管がバンドルに編成されるときに発生する変化をリアルタイムで監視することができます。ここで説明する方法は、個々のタンパク質の活性および局在化の体系的な評価、ならびに同一の実験条件下での2つの異なる微小管サブセットに対するタンパク質調節因子の相乗効果を可能にし、それによって他の方法ではアクセスできない機構的洞察を提供する。
Introduction
微小管は、細胞内輸送および細胞小器官の位置決めから細胞分裂および伸長に至るまで、複数の細胞プロセスに不可欠な構造足場を形成する生体高分子である。これらの多様な機能を実行するために、個々の微小管は、有糸分裂紡錘体、毛様体軸索、ニューロンバンドル、相間配列、および植物皮質配列などのミクロンサイズの配列に編成される。これらの構造に見られる普遍的な建築モチーフは、その長さに沿って架橋された微小管の束です1。いくつかの微小管ベースの構造の興味深い特徴は、束ねられた微小管と非架橋された単一の微小管が空間的に近接して共存することである。これらの微小管亜集団は、その適切な機能のために必要なように、互いに著しく異なる重合ダイナミクスを示すことができる2,3,4,5。例えば、有糸分裂紡錘体内では、安定な架橋束および動的単一微小管が、細胞中心のミクロンスケール領域内に存在する6。したがって、共存する微小管集団の動的特性がどのように特定されるかを研究することは、微小管ベースの構造の組み立てと機能を理解する上で中心的である。
微小管は、重合と解重合の相を循環する動的なポリマーであり、大惨事と救助として知られるイベントで2つの相を切り替えます7。細胞微小管のダイナミクスは、微小管の重合および解重合の速度、ならびに大惨事および救助事象の頻度を調節する無数の微小管関連タンパク質(MAP)によって調節される。細胞内の空間的に近位アレイ上のMAPの活性を調べることは、光学顕微鏡、特に微小管密度の高い領域における空間分解能の限界のために困難である。さらに、同じ細胞領域に複数のMAPが存在することは、細胞生物学的研究の解釈を妨げる。全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法と組み合わせて実施されるインビトロ再構成アッセイは、MAPの特定のサブセットが近位細胞微小管アレイのダイナミクスを調節するメカニズムを調べるという課題を回避します。ここで、インビトロで組み立てられた微小管の動態は、制御された条件下で1つ以上の組換えMAPの存在下で調べられる8、9、10。 しかしながら、従来の再構成アッセイは、典型的には、単一の微小管または1つのタイプのアレイ上で行われ、共存する集団の可視化を妨げる。
ここでは、同じ溶液条件下で2つの微小管集団を同時に可視化することを可能にするin vitro 再構成アッセイを紹介します11。我々は、単一の微小管および有糸分裂紡錘体関連タンパク質PRC1によって架橋された微小管束上の複数のMAPの集合活性を同時に見る方法を説明する。タンパク質PRC1は、抗平行微小管間の重なりで優先的に結合し、それらを架橋する9。簡単に言えば、このプロトコルは、(i)原液および試薬の調製、(ii)顕微鏡実験用のイメージングチャンバの作成に使用されるカバースリップの洗浄および表面処理、(iii)実験中に重合が開始される安定した微小管「種子」の調製、(iv)微小管ダイナミクスを視覚化するためのTIRF顕微鏡設定の仕様、(v)微小管種子の固定化および架橋微小管束の生成 画像化チャンバ内において、(vi)TIRF顕微鏡による画像化チャンバ内の微小管ダイナミクスの可視化、可溶性チューブリン、MAP、およびヌクレオチドの添加時。これらのアッセイは、MAP局在化および2つの微小管集団の動態に対するそれらの影響の定性的評価および定量的検査を可能にする。さらに、これらの微小管集団に対する複数のMAPの相乗効果の評価を、幅広い実験条件にわたって容易にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する実験は、従来、単一の微小管または1種類のアレイで実施される従来の微小管再構成アッセイの範囲と複雑さを大幅に拡大します。現在のアッセイは、2つの集団、すなわち単一の微小管および架橋束に対する調節MAP活性を同時に定量および比較する方法を提供する。さらに、このアッセイでは、ダイナミクスの開始前に安定な種子から予め形成されたバンドルと、2つの成長末?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この活動は、NIH(no. 1DP2GM126894-01)からの助成金と、ピュー慈善信託とスミスファミリー財団からR.S.への資金によって支援されました。著者らは、プロトコルの開発と最適化に対するShuo Jiang博士の貢献に感謝する。
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
References
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