본 프로토콜은 P. americana에서 RNAi 조작 기술에 대한 단계별 지침을 설명합니다.
위생 해충 인 바퀴벌레는 쉬운 먹이와 반대사 적 특성으로 인해 곤충 발달 및 변형 연구에서 필수적인 종입니다. 주석이 잘 달린 게놈 서열과 함께, 이러한 장점은 미국 바퀴벌레 인 Periplaneta americana를 중요한 반대사 곤충 모델로 만들었습니다. 녹아웃 전략의 부족으로 제한되는 효과적인 RNA 간섭 (RNAi) 기반 유전자 녹다운은 P. americana의 기능적 유전자 연구에 없어서는 안될 기술이됩니다. 본 프로토콜은 P. americana에서의 RNAi 조작 기술을 기술한다. 프로토콜은 (1) 적절한 발달 단계에서 P. americana 의 선택, (2) 주사 설정을위한 준비, (3) dsRNA 주사, 및 (4) 유전자 녹다운 효율 검출을 포함한다. RNAi는 P. americana의 강력한 역 유전 도구입니다. P. americana 조직의 대부분은 세포외 dsRNA에 민감하다. 그것의 단순성은 연구자가 하나 또는 여러 개의 표적화 dsRNA 주사 하에서 기능 장애 표현형을 신속하게 얻을 수있게하여 연구자가 발달 및 변형 연구에 P. americana를 더 잘 사용할 수있게 해줍니다.
진화적으로 보존된 기전인 RNA 간섭(RNAi)은 앤드류 파이어(Andrew Fire)와 크레이그 멜로 2(Craig Mello2)가 이중 가닥 RNA(dsRNA) 매개 유전자 침묵 전략을 개발했기 때문에 점차 많은 유기체1에서 유전자 발현을 억제하는 필수적인 역유전학적 도구가 된다. dsRNA는 21-23 뉴클레오티드의 단편으로 절단되고, 작은 간섭 RNA (siRNAs)는, 세포 내의 다이서 효소에 의해 RNAi 경로를 활성화시킨다. 그런 다음 siRNA가 표적 mRNA에 결합하고 mRNA 절단을 일으키고, 최종적으로 유전자 기능 3,4,5의 손실을 초래하는 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에 혼입된다. 곤충 종 중에서, 많은 전신 RNAi 실험은 지금까지 Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera 및 Blattodea 5,6,7,8과 같은 많은 곤충 순서에서보고되었습니다.
바퀴벌레 (Blattaria)는 급속한 성장주기, 환경에 대한 강한 적응력 및 높은 발달 가소성으로 발달 및 변형 연구에서 필수적인 곤충 군입니다9. RNAi가 바퀴벌레와 호환된다는 것을 발견하기 전에 이전 연구는 바퀴벌레의 유전자 조작 기술이 부족하기 때문에 바퀴벌레 예방 및 통제에만 중점을 두었습니다. 바퀴벌레 오테카의 독특한 구조는 CRISPR-Cas9 시스템으로 배아 주입 기반 유전자 녹아웃을 수행하는 것을 어렵게 만들었습니다. 게다가, 바퀴벌레의 대부분의 조직 (예 : P. americana)은 강력한 전신 RNAi 반응을 보여 하나 이상의 표적화 dsRNAs 9,10,11을 주입하여 기능 장애 표현형을 신속하게 생성 할 수 있습니다. 이러한 특징은 RNAi를 P. americana의 유전자 기능 연구에서 없어서는 안될 기술로 만들었습니다.
P. americana의 기능적 유전자 연구에서 RNAi의 사용이보고되었지만 상세하거나 단계별 설명은 제공되지 않았습니다. 이 보고서는 다른 바퀴벌레의 유전자 기능 연구에 유용한 P. americana의 RNAi에 대한 단계별 운영 지침을 제공합니다. 또한,이 가이드는 Blattodea에 국한되지 않으며 사소한 수정으로 다른 많은 곤충에 적용 할 수 있습니다.
이 보고서는 P. americana의 방법론적 단계별 RNAi 전략을 기술하였다; 참고로, 그것은 또한 다른 바퀴벌레 (예 : Blattella germanica )와 사소한 변화가있는 다른 많은 곤충에도 적용될 수 있습니다. 그러나, RNAi의 유전자 침묵 효율이 항상 충분히 높은 것은 아니며, 유전자 녹아웃 전략(13)과 비교하여 명백한 단점이 있다. 유전자 수준의 다음의 잔류 효과는 실제 표현형을 방?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 32070500, 31620103917, 31330072 및 31572325 C.R., Sh.L.), 광동성 자연 과학 재단 (보조금 번호 2021B1515020044 및 2020A1515011267 ~ C.R.), 광동성 과학 기술부 (보조금 번호 2019B090905003 및 2019A0102006), 광저우 과학 기술부 (보조금 번호 202102020110), 심천 과학 기술 프로그램 (보조금 번호. KQTD20180411143628272 to Sh.L.).
701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |