Amerikan Hamamböceğinde RNA Girişiminin Uygulamaları
Summary
Mevcut protokol, P. americana’daki RNAi operasyon teknikleri için adım adım kılavuzları açıklamaktadır.
Abstract
Sıhhi bir haşere olan hamamböceği, kolay beslenme ve hemimetabolöz özellikleri nedeniyle böcek gelişimsel ve metamorfik çalışmalarında vazgeçilmez türlerdir. İyi açıklamalı genom dizileri ile birlikte, bu avantajlar Amerikan hamamböceği, Periplaneta americana’yı önemli bir hemimetabolöz böcek modeli haline getirmiştir. Nakavt stratejisinin yetersizliği ile sınırlı olarak, etkili RNA girişimi (RNAi) tabanlı gen nakavtı, P. americana’nın fonksiyonel gen araştırmalarında vazgeçilmez bir teknik haline gelir. Mevcut protokol P. americana’daki RNAi operasyon tekniklerini açıklamaktadır. Protokol, (1) uygun gelişim aşamalarında P . americana’nın seçimini, (2) enjeksiyon ayarına hazırlık, (3) dsRNA enjeksiyonu ve (4) gen nakavt verimliliği tespitini içerir. RNAi, P. americana’da güçlü bir ters genetik araçtır. P. americana dokularının çoğunluğu hücre dışı dsRNA’ya duyarlıdır. Sadeliği, araştırmacıların bir veya daha fazla hedefleme dsRNA enjeksiyonu altında işlevsiz fenotipleri hızlı bir şekilde elde etmelerini sağlayarak araştırmacıların gelişimsel ve metamorfik çalışmalar için P. americana’yı daha iyi kullanmalarını sağlar.
Introduction
Evrimsel olarak korunmuş bir mekanizma olan RNA girişimi (RNAi), Andrew Fire ve Craig Mello2’nin çift sarmallı RNA (dsRNA) aracılı gen sessizliği stratejisini geliştirmesinden bu yana, yavaş yavaş birçok organizmada gen ekspresyonunu inhibe etmek için gerekli bir ters-genetik araç haline gelir1. dsRNA, RNAi yolunu aktive etmek için hücrelerdeki Dicer enzimi tarafından 21-23 nükleotid, küçük müdahale eden RNA’lar (siRNA’lar) fragmanlarına bölünür. Daha sonra siRNA’lar, hedef mRNA ile çiftleşen, mRNA bölünmesine neden olan ve son olarakgen fonksiyonunun 3,4,5 kaybına neden olan RNA kaynaklı susturma kompleksine (RISC) dahil edilir. Böcek türleri arasında, şimdiye kadar Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera ve Blattodea 5,6,7,8 gibi birçok sistemik RNAi deneyi bildirilmiştir.
Hamamböceği (Blattaria), hızlı büyüme döngüleri, çevreye güçlü adaptasyonu ve yüksek gelişimsel plastisitesi9 ile gelişimsel ve metamorfik çalışmalarda önemli bir böcek ailesidir. RNAi’nin hamamböceği ile uyumlu olduğunu keşfetmeden önce, önceki araştırmalar hamamböceklerinde genetik manipülasyon tekniklerinin azlığı nedeniyle sadece hamamböceği önleme ve kontrolüne odaklandı. Hamamböceği ootheca’nın eşsiz yapısı, CRISPR-Cas9 sistemi ile embriyo enjeksiyonuna dayalı gen nakavtını gerçekleştirmeyi zorlaştırdı. Ayrıca, hamamböceklerindeki çoğu doku (P. americana gibi) sağlam sistemik RNAi yanıtı gösterir ve bir veya daha fazla dsRNA’yı 9,10,11 hedefleyerek disfonksiyonel fenotiplerin hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Bu özellikler RNAi’yi P. americana’daki gen fonksiyonel araştırmalarında vazgeçilmez bir teknik haline getirdi.
RNAi’nin P. americana’daki fonksiyonel gen araştırmalarında kullanımı bildirilmiş olmasına rağmen, ayrıntılı veya adım adım bir açıklama mevcut değildi . Bu rapor, P. americana’daki RNAi için diğer hamamböceklerinde gen fonksiyonu çalışması için yararlı olan adım adım operasyonel bir kılavuz sunmaktadır. Ayrıca, bu kılavuz Blattodea ile sınırlı değildir ve küçük değişikliklerle diğer birçok böceğe uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu rapor, P. americana’da metodolojik bir adım adım RNAi stratejisini tanımladı; Not olarak, diğer hamamböceklerine (örneğin Blattella germanica ) ve küçük değişikliklerle diğer birçok böceğe de uygulanabilir. Bununla birlikte, RNAi’nin gen susturma etkinliği her zaman yeterince yüksek değildir, gen nakavt stratejisi13 ile karşılaştırıldığında belirgin bir dezavantaj vardır. Gen seviyesinin aşağıdaki kalıntı etkisi, gerçek fenotiplere müdahale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32070500, 31620103917, 31330072 ve C.R., Sh.L.’ye 31572325), Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 2021B1515020044 ve 2020A1515011267 C.R.), Guangdong Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bölümü (Hibe No. 2019B090905003 ve 2019A0102006), Guangzhou’daki Bilim ve Teknoloji Bölümü (Hibe No. 202102020110), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Programı tarafından (Hibe No. KQTD20180411143628272 için Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
