Количественная оценка подвижности роя бактериальной поверхности на градиентных пластинах индуктора
Summary
Здесь мы описываем использование пластин градиента индуктора для оценки подвижности бактериального роя при одновременном получении множественных реакций концентрации.
Abstract
Бактериальная роевая подвижность является распространенным микробиологическим фенотипом, который бактериальные сообщества используют для миграции по полутвердым поверхностям. При исследованиях индуцированной роевой подвижности специфическая концентрация индуктора может быть не в состоянии сообщить о событиях, происходящих в пределах оптимального диапазона концентраций, чтобы вызвать желаемые ответы у вида. Полутвердые пластины, содержащие несколько концентраций, обычно используются для исследования реакции в диапазоне концентраций индуктора. Однако отдельные полутвердые пластины увеличивают изменения вязкости среды и содержания влаги в каждой пластине из-за неравномерного времени затвердевания.
В данной работе описан одноэтапный метод одновременного испытания подвижности роя поверхности на одной градиентной пластине, где изометрически расположенные испытательные скважины позволяют одновременно получать мультиконцентрационные ответы. В настоящей работе поверхностное роение Escherichia coli K12 и Pseudomonas aeruginosa PAO1 оценивали в ответ на градиент концентрации индукторов, таких как ресвератрол и арабиноза. Периодически морфологии роя визуализировались с использованием системы визуализации для захвата всего процесса роения поверхности.
Количественное измерение морфологии роя было получено с помощью программного обеспечения ImageJ, предоставляющего анализируемую информацию о области роя. В данной работе представлен простой метод градиентных роевых пластин, который предоставляет качественную и количественную информацию о влиянии индукторов на поверхностное роение, которая может быть расширена для изучения воздействия других индукторов на более широкий спектр подвижных видов бактерий.
Introduction
Бактериальная роевая подвижность относится к коллективной миграции бактериальных клеток по поверхности вещества. В дополнение к полутвердым агаровым пластинам, специально подготовленным в лаборатории1, этот фенотип также наблюдается на некоторых мягких субстратах, таких как ткани животных2, гидратированные поверхности3 и корни растений4. В то время как полутвердая поверхность считается одним из фундаментальных условий для бактериального роения, некоторым видам также требуется богатая энергией среда для поддержки их роевой подвижности5. Вращение жгутиков как плавает, так и роевая подвижность – плавание описывает одноклеточную подвижность в жидкой среде, тогда как роение – это синхронное движение микробной популяции по полутвердым поверхностям.
Вязкость субстрата влияет на подвижность бактерий; Исследования патогенных микробов, таких как Helicobacter pylori, показали, что подвижность возбудителя изменяется в зависимости от вязкости слоя муцина, на которую влияет закисление окружающей среды в организме человека-хозяина6. Чтобы воспроизвести эти среды, более ранние исследования с использованием концентрации агара выше 0,3% (мас./об.) ограничивают подвижность бактериального плавания, чтобы обеспечить постепенный переход к поверхностному роению. Использование концентрации агара выше 1% (мас./об.) предотвращает роение подвижности многих видов7. Колониальные узоры, образующиеся на поверхности, разнообразны, включая безликий mat8, бычий глаз9, дендриты10 и вихрь11.
Хотя актуальность таких моделей остается неясной, эти модели, по-видимому, зависят от экологических и химических сигналов12. Экологические сигналы охватывают различные аспекты, включая температуру, соленость, свет и рН, тогда как химические сигналы включают присутствие молекул микробного кворума, биохимических побочных продуктов и питательных веществ. Сигнальные молекулы, чувствительные к кворуму, такие как AHL (N-гексаноил-L гомосерин лактон), могут влиять на поверхностное роение, регулируя выработку поверхностно-активного вещества13,14. Ресвератрол, соединение фитоалексинов, может ограничить подвижность бактериального роя15.
В настоящей работе исследуется влияние градиентных концентраций ресвератрола на штамм Escherichia coli K12 дикого типа и исследуется арабиноза-индуцируемая роевая подвижность инженерных видов E. coli K12-YdeH и Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. Производство фермента YdeH индуцируется арабинозой через промотор araBAD, что приводит к клеточному возмущению c-di-GMP и влияет на подвижность бактериального роения16,17. Это индуцируемое роевое поведение изучается с использованием арабинозных градиентных роевых пластин с штаммами E. coli K12-YdeH и P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Градиентные роевые пластины получают путем последовательного затвердевания двухслойной среды (рис. 1В). Нижний слой содержит среду, добавленную с индуктором, вылитую на одну сторону подпираемой чашки Петри. После затвердевания нижнего слоя чашка Петри возвращается на плоскую поверхность, где верхний слой, содержащий среду без индуктора, добавляется с другой стороны пластины. После того, как роевые пластины полностью затвердевают, изометрически расположенные удерживающие скважины получают путем бурения отверстий на роевых пластинах по фиксированной компоновке (рисунок 1C) или путем отпечатывания скважин с использованием 3D-печатной модели крышки пластины, содержащей колышки, во время процесса отверждения среды (дополнительный рисунок S1). Гелевая система визуализации используется для захвата роевых морфологий в разные моменты времени (рисунок 2). Анализ поверхностного роения с помощью программного обеспечения ImageJ (дополнительный рисунок S2) дает количественные результаты процесса поверхностного роения (рисунок 3).
Таким образом, мы предлагаем простой метод проверки подвижности роя поверхности в диапазоне концентраций индукторов. Этот метод может быть использован для проверки множественных реакций концентрации других индукторов путем смешивания индуктора в среде нижнего слоя и может быть применен к другим подвижным видам (например, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Этот подход может обеспечить надежные качественные и количественные результаты для скрининга одного химического индуктора, и отдельные пластины могут быть использованы для оценки большего количества химических индукторов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследование подвижности бактериального роения на полутвердых градиентных пластинах может быть сложной задачей18,19,20, поскольку оно включает в себя множество факторов, таких как вязкость субстрата, влажность и компоненты среды. Среди …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Разработка этой методики была поддержана средствами Национального ключевого плана исследований и разработок Министерства науки и технологий (2018YF0902604), Национального фонда естественных наук Китая, Исследовательского фонда для международных молодых ученых (22050410270) и Внешних фондов Шэньчжэньских институтов передовых технологий (DWKF20190001). Мы хотели бы выразить нашу искреннюю благодарность мисс Чэнь Синьи за ее помощь в корректуре документа и управлении лабораторией.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
