Inducer Gradient प्लेट्स पर बैक्टीरियल सतह swarming गतिशीलता परिमाणित करना
Summary
यहां, हम एक साथ कई एकाग्रता प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करते हुए बैक्टीरियल स्वार्मिंग गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए प्रेरक ग्रेडिएंट प्लेटों के उपयोग का वर्णन करते हैं।
Abstract
बैक्टीरियल स्वार्मिंग गतिशीलता एक आम सूक्ष्मजीवविज्ञानी फेनोटाइप है जिसका उपयोग जीवाणु समुदाय अर्ध-ठोस सतहों पर प्रवास करने के लिए करते हैं। प्रेरित झुकाव गतिशीलता की जांच में, एक प्रेरक की विशिष्ट एकाग्रता एक प्रजाति से वांछित प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए इष्टतम एकाग्रता सीमा के भीतर होने वाली घटनाओं की रिपोर्ट करने में सक्षम नहीं हो सकती है। कई सांद्रता वाले अर्धठोस प्लेटों का उपयोग आमतौर पर एक प्रेरक एकाग्रता सीमा के भीतर प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए किया जाता है। हालांकि, अलग-अलग अर्ध-ठोस प्लेटें गैर-समान ठोसीकरण समय के कारण प्रत्येक प्लेट के भीतर मध्यम चिपचिपाहट और नमी सामग्री में भिन्नताओं को बढ़ाती हैं।
यह पेपर एक एकल ग्रेडिएंट प्लेट पर सतह की गतिशीलता का एक साथ परीक्षण करने के लिए एक-चरणीय विधि का वर्णन करता है, जहां सममितीय रूप से व्यवस्थित परीक्षण कुओं ने बहु-एकाग्रता प्रतिक्रियाओं के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति दी है। वर्तमान काम में, Escherichia coli K12 और Pseudomonas aeruginosa PAO1 की सतह swarming इस तरह resveratrol और arabinose के रूप में inducers की एक एकाग्रता ढाल के जवाब में मूल्यांकन किया गया था। समय-समय पर, झुंड morphologies पूरी सतह swarming प्रक्रिया पर कब्जा करने के लिए एक इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर छवि बनाई गई थी।
झुंड morphologies के मात्रात्मक माप ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अधिग्रहित किया गया था, झुंड क्षेत्र की analyzable जानकारी प्रदान करते हैं. यह पेपर एक सरल ग्रेडिएंट झुंड प्लेट विधि प्रस्तुत करता है जो सतह के झुंड पर प्रेरकों के प्रभावों के बारे में गुणात्मक और मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है, जिसे मोटिल बैक्टीरियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर अन्य प्रेरकों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
बैक्टीरियल स्वार्मिंग गतिशीलता एक पदार्थ की सतह पर जीवाणु कोशिकाओं के सामूहिक प्रवास को संदर्भित करती है। प्रयोगशाला 1 में विशेष रूप से तैयार किए गए अर्ध-ठोस आगर प्लेटों के अलावा, यह फेनोटाइप कुछ नरम सब्सट्रेट्स जैसे कि पशु ऊतक2, हाइड्रेटेड सतहों 3 और पौधों की जड़ों पर भी मनाया जाता है। जबकि एक अर्ध-ठोस सतह को जीवाणु झुंड के लिए मौलिक स्थितियों में से एक माना जाता है, कुछ प्रजातियों को अपनी झुकाव गतिशीलता का समर्थन करने के लिए ऊर्जा समृद्ध माध्यम की भी आवश्यकता होती है5। फ्लैगेला रोटेशन दोनों तैराकी और झुकाव गतिशीलता-तैराकी दोनों शक्तियों को एक तरल वातावरण के भीतर एककोशिकीय गतिशीलता का वर्णन करता है, जबकि झुंड अर्ध-ठोस सतहों पर एक माइक्रोबियल आबादी का तुल्यकालिक आंदोलन है।
सब्सट्रेट चिपचिपाहट जीवाणु गतिशीलता को प्रभावित करती है; रोगजनक रोगाणुओं के अध्ययन, जैसे कि हेलिकोबैक्टर पाइलोरी, से पता चला है कि रोगज़नक़ की गतिशीलता म्यूसिन परत चिपचिपाहट के आधार पर बदलती है, जो मानव मेजबान 6 में पर्यावरणीय अम्लीकरण से प्रभावित होती है। इन वातावरणों को दोहराने के लिए, 0.3% (डब्ल्यू / वी) से ऊपर आगर एकाग्रता का उपयोग करके पहले के अध्ययन सतह के झुंड में क्रमिक बदलाव को प्रभावित करने के लिए जीवाणु तैराकी गतिशीलता को प्रतिबंधित करते हैं। 1% (डब्ल्यू / वी) से ऊपर आगर एकाग्रता का उपयोग कई प्रजातियों की झुकाव गतिशीलता को रोकता है7। सतह पर गठित कॉलोनी पैटर्न विविध हैं, जिनमें फीचरलेस मैट 8, बैल की आंख9, डेंड्राइट्स 10 और भंवर 11 शामिल हैं।
हालांकि इस तरह के पैटर्न की प्रासंगिकता अस्पष्ट बनी हुई है, लेकिन वे पैटर्न पर्यावरण और रासायनिक cues12 पर निर्भर प्रतीत होते हैं। पर्यावरणीय संकेत तापमान, लवणता, प्रकाश और पीएच सहित विभिन्न पहलुओं को कवर करते हैं, जबकि रासायनिक संकेतों में माइक्रोबियल कोरम संवेदन अणुओं, जैव रासायनिक उपोत्पादों और पोषक तत्वों की उपस्थिति शामिल है। Autoinducer कोरम संवेदन सिग्नलिंग अणुओं जैसे AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) surfactant13,14 के उत्पादन को विनियमित करके सतह swarming को प्रभावित कर सकते हैं। Resveratrol, एक phytoalexin यौगिक, जीवाणु swarming गतिशीलता 15 को प्रतिबंधित कर सकता है।
वर्तमान काम में, हम जंगली प्रकार Escherichia कोलाई K12 तनाव पर resveratrol के ढाल सांद्रता के प्रभाव की जांच करते हैं और इंजीनियर ई कोलाई K12-YdeH और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा PAO1-YdeH प्रजातियों की arabinose-inducible swarming गतिशीलता की जांच करते हैं। YdeH एंजाइम का उत्पादन araBAD प्रमोटर के माध्यम से arabinose द्वारा प्रेरित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर c-di-GMP गड़बड़ी होती है और बैक्टीरिया के झुंड गतिशीलता को प्रभावित करती है16,17। इस inducible swarming व्यवहार का अध्ययन ई कोलाई K12-YdeH और P. aeruginosa PAO1-YdeH उपभेदों के साथ arabinose ग्रेडिएंट झुंड प्लेटों का उपयोग करके किया जाता है।
ग्रेडिएंट झुंड प्लेटों को क्रमिक रूप से डबल-लेयर माध्यम (चित्रा 1 बी) को मजबूत करके तैयार किया जाता है। नीचे की परत में प्रेरक के साथ जोड़ा गया माध्यम शामिल है, जो एक प्रोप्ड-अप पेट्री डिश के एक तरफ डाला जाता है। नीचे की परत के ठोसीकरण पर, पेट्री डिश को एक सपाट सतह पर वापस कर दिया जाता है, जहां प्रेरक के बिना माध्यम वाली ऊपरी परत को प्लेट के दूसरी तरफ से जोड़ा जाता है। झुंड प्लेटों को पूरी तरह से ठोस करने के बाद, आइसोमेट्रिक रूप से व्यवस्थित होल्डिंग-कुओं को एक निश्चित लेआउट (चित्रा 1 सी) के बाद झुंड प्लेटों पर उबाऊ छेद द्वारा उत्पादित किया जाता है या मध्यम इलाज प्रक्रिया (पूरक चित्रा S1) के दौरान खूंटे वाले प्लेट कवर के 3 डी मुद्रित मॉडल का उपयोग करके कुओं को छापकर उत्पादित किया जाता है। एक जेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग विभिन्न समय बिंदुओं पर झुंड आकृति विज्ञान को कैप्चर करने के लिए किया जाता है (चित्रा 2)। ImageJ सॉफ़्टवेयर (पूरक चित्रा S2) का उपयोग करके सतह swarming का विश्लेषण सतह swarming प्रक्रिया (चित्रा 3) के मात्रात्मक परिणाम प्रदान करता है।
इस प्रकार, हम प्रेरकों की एकाग्रता सीमा के भीतर सतह के झुंड गतिशीलता का परीक्षण करने के लिए एक सरल विधि का प्रस्ताव करते हैं। इस विधि का उपयोग नीचे-परत माध्यम में प्रेरक को मिलाकर अन्य प्रेरकों की कई एकाग्रता प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है और इसे अन्य गतिशील प्रजातियों (जैसे, बैसिलस सबटिलिस, साल्मोनेला एंटेरिका, प्रोटियस मिराबिलिस, येर्सिनिया एंटरोकोलिटिका) पर लागू किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण एक एकल रासायनिक प्रेरक की स्क्रीनिंग के लिए विश्वसनीय गुणात्मक और मात्रात्मक परिणाम प्रदान कर सकता है, और अधिक रासायनिक प्रेरकों का मूल्यांकन करने के लिए अलग-अलग प्लेटों को नियोजित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अर्ध-ठोस ढाल प्लेटों पर बैक्टीरियल स्वार्मिंग गतिशीलता की जांच एक चुनौतीपूर्ण कार्य 18,19,20 हो सकती है, क्योंकि इसमें सब्सट्रेट चिपचिपाहट, आर्द्रता और मध्यम घटक जैसे कई कारक शा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस तकनीक के विकास को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय की राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास योजना (2018YF0902604), अंतर्राष्ट्रीय युवा वैज्ञानिकों (22050410270) के लिए चीन के अनुसंधान कोष के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन और शेन्ज़ेन इंस्टीट्यूट ऑफ एडवांस्ड टेक्नोलॉजी एक्सटर्नल फंड (DWKF20190001) से धन द्वारा समर्थित किया गया था। हम दस्तावेज़ और प्रयोगशाला प्रबंधन को प्रूफरीडिंग में उनकी सहायता के लिए मिस चेन शिनी के प्रति हमारी ईमानदारी से कृतज्ञता व्यक्त करना चाहते हैं।
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
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