قياس حركة احتشاد السطح البكتيري على ألواح التدرج المحفزة
Summary
هنا ، نصف استخدام لوحات التدرج المحفزة لتقييم حركة الاحتشاد البكتيري مع الحصول في نفس الوقت على استجابات تركيز متعددة.
Abstract
حركة الاحتشاد البكتيري هي نمط ظاهري ميكروبيولوجي شائع تستخدمه المجتمعات البكتيرية للهجرة فوق الأسطح شبه الصلبة. في التحقيقات المتعلقة بحركية السرب المستحثة ، قد لا يتمكن التركيز المحدد للمحفز من الإبلاغ عن الأحداث التي تحدث ضمن نطاق التركيز الأمثل للحصول على الاستجابات المطلوبة من الأنواع. تستخدم الصفائح شبه الصلبة التي تحتوي على تركيزات متعددة بشكل شائع للتحقيق في الاستجابة داخل نطاق تركيز المحرض. ومع ذلك ، فإن الألواح شبه الصلبة المنفصلة تزيد من الاختلافات في اللزوجة المتوسطة ومحتوى الرطوبة داخل كل لوحة بسبب وقت التصلب غير المنتظم.
تصف هذه الورقة طريقة من خطوة واحدة لاختبار حركة الاحتشاد السطحي في وقت واحد على لوحة تدرج واحدة ، حيث تسمح آبار الاختبار المرتبة بشكل متساوي القياس بالاكتساب المتزامن للاستجابات متعددة التركيزات. في هذا العمل ، تم تقييم الاحتشاد السطحي للإشريكية القولونية K12 و Pseudomonas aeruginosa PAO1 استجابة لتدرج تركيز المحفزات مثل ريسفيراترول وأرابينوز. بشكل دوري ، تم تصوير مورفولوجيات السرب باستخدام نظام تصوير لالتقاط عملية احتشاد السطح بأكملها.
تم الحصول على القياس الكمي لمورفولوجيا السرب باستخدام برنامج ImageJ ، مما يوفر معلومات قابلة للتحليل لمنطقة السرب. تقدم هذه الورقة طريقة بسيطة لصفيحة سرب التدرج توفر معلومات نوعية وكمية حول تأثيرات المحفزات على الحشود السطحية ، والتي يمكن توسيعها لدراسة آثار المحفزات الأخرى على مجموعة أوسع من الأنواع البكتيرية المتحركة.
Introduction
تشير حركية الاحتشاد البكتيري إلى الهجرة الجماعية للخلايا البكتيرية عبر سطح المادة. بالإضافة إلى ألواح الأجار شبه الصلبة المعدة خصيصا في المختبر1، لوحظ هذا النمط الظاهري أيضا على بعض الركائز الرخوة مثل الأنسجة الحيوانية2 والأسطح المائية3 وجذور النباتات4. في حين يعتبر السطح شبه الصلب أحد الشروط الأساسية لاحتشاد البكتيريا، فإن بعض الأنواع تتطلب أيضا وسيطا غنيا بالطاقة لدعم حركتها الكثيفة5. يعمل دوران السوط على كل من السباحة والسباحة الحركية – تصف السباحة الحركة أحادية الخلية داخل بيئة سائلة ، في حين أن السرب هو الحركة المتزامنة لمجموعة ميكروبية عبر الأسطح شبه الصلبة.
لزوجة الركيزة تؤثر على الحركة البكتيرية. وقد أظهرت الدراسات التي أجريت على الميكروبات المسببة للأمراض، مثل هيليكوباكتر بيلوري، أن حركية العامل الممرض تتغير اعتمادا على لزوجة طبقة الميوسين، التي تتأثر بالتحمض البيئي في المضيف البشري6. لتكرار هذه البيئات ، فإن الدراسات السابقة التي استخدمت تركيز أجار أعلى من 0.3٪ (ث / v) تقيد حركة السباحة البكتيرية لإحداث تحول تدريجي في الاحتشاد السطحي. إن استخدام تركيز الأجار فوق 1٪ (ث / ف) يمنع حركة الاحتشاد للعديد من الأنواع 7. أنماط المستعمرة التي تشكلت على السطح متنوعة ، بما في ذلك mat8 عديمة الميزات ، عين الثور 9 ، التشعبات 10 ، والدوامة11.
وعلى الرغم من أن أهمية هذه الأنماط لا تزال غير واضحة، يبدو أن هذه الأنماط تعتمد على الإشارات البيئية والكيميائية12. تغطي الإشارات البيئية جوانب مختلفة ، بما في ذلك درجة الحرارة والملوحة والضوء ودرجة الحموضة ، في حين تشمل الإشارات الكيميائية وجود جزيئات استشعار النصاب الميكروبي ، والمنتجات الثانوية الكيميائية الحيوية ، والمواد المغذية. يمكن أن تؤثر جزيئات إشارات استشعار النصاب الذاتي مثل AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) على الحشود السطحية من خلال تنظيم إنتاج الفاعل بالسطح13,14. ريسفيراترول ، وهو مركب فيتواليكسين ، يمكن أن يحد من حركة الاحتشاد البكتيري 15.
في هذا العمل ، نقوم بالتحقيق في تأثير تركيزات التدرج من ريسفيراترول على سلالة الإشريكية القولونية K12 من النوع البري ونحقق في حركية السرب المستحثة بأرابينوز لأنواع E. coli K12-YdeH و Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. يتم تحفيز إنتاج إنزيم YdeH بواسطة arabinose عبر مروج araBAD ، مما يؤدي إلى اضطراب c-di-GMP الخلوي ويؤثر على حركية الاحتشاد البكتيري 16,17. تتم دراسة سلوك الاحتشاد المستحث هذا باستخدام ألواح سرب التدرج أرابينوز مع سلالات E. coli K12-YdeH و P. aeruginosa PAO1-YdeH.
يتم تحضير ألواح السرب المتدرجة عن طريق تصلب وسط مزدوج الطبقة على التوالي (الشكل 1B). تتكون الطبقة السفلية من الوسط المضاف مع المحفز ، ويسكب على جانب واحد من طبق بتري مدعوم. عند تصلب الطبقة السفلية ، يتم إرجاع طبق بتري إلى سطح مستو ، حيث تتم إضافة الطبقة العليا التي تحتوي على الوسط بدون المحفز من الجانب الآخر من اللوحة. بعد أن يتم تصلب ألواح السرب بالكامل ، يتم إنتاج آبار الاحتفاظ المرتبة بشكل متساوي القياس عن طريق ثقوب مملة على ألواح السرب بعد تخطيط ثابت (الشكل 1C) أو عن طريق طباعة الآبار باستخدام نموذج مطبوع ثلاثي الأبعاد لغطاء اللوحة يحتوي على أوتاد أثناء عملية المعالجة المتوسطة (الشكل التكميلي S1). يستخدم نظام التصوير الهلامي لالتقاط مورفولوجيات السرب في نقاط زمنية مختلفة (الشكل 2). يوفر تحليل الاحتشاد السطحي باستخدام برنامج ImageJ (الشكل التكميلي S2) نتائج كمية لعملية الاحتشاد السطحي (الشكل 3).
وبالتالي ، نقترح طريقة بسيطة لاختبار حركة السرب السطحي داخل نطاق تركيز من المحرضات. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار استجابات تركيز متعددة للمحفزات الأخرى عن طريق خلط المحفز في وسط الطبقة السفلية ويمكن تطبيقها على الأنواع المتحركة الأخرى (على سبيل المثال ، Bacillus subtilis ، Salmonella enterica ، Proteus mirabilis ، Yersinia enterocolitica). يمكن أن يوفر هذا النهج نتائج نوعية وكمية موثوقة لفحص محفز كيميائي واحد ، ويمكن استخدام لوحات منفصلة لتقييم المزيد من المحفزات الكيميائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن يكون التحقيق في حركة الاحتشاد البكتيري على ألواح التدرج شبه الصلبة مهمة صعبة18،19،20 ، لأنها تنطوي على عوامل متعددة مثل لزوجة الركيزة والرطوبة والمكونات المتوسطة. من بين هذه العوامل ، يلعب تركيز الأجار دورا حاسما في تحديد الارتداد ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم تطوير هذه التقنية من خلال الأموال المقدمة من خطة البحث والتطوير الرئيسية الوطنية لوزارة العلوم والتكنولوجيا (2018YF0902604) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية التابعة لصندوق أبحاث الصين للعلماء الشباب الدوليين (22050410270) والصناديق الخارجية لمعاهد شنتشن للتكنولوجيا المتقدمة (DWKF20190001). نود أن نقدم خالص امتناننا للآنسة تشن شينيي لمساعدتها في التدقيق اللغوي للوثيقة وإدارة المختبر.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
