Kwantificering van de zwermmotiliteit van het bacteriële oppervlak op gradiëntplaten van inductoren
Summary
Hier beschrijven we het gebruik van inducergradiëntplaten om bacteriële zwermmotiliteit te evalueren en tegelijkertijd meerdere concentratieresponsen te verkrijgen.
Abstract
Bacteriële zwermmotiliteit is een veel voorkomend microbiologisch fenotype dat bacteriële gemeenschappen gebruiken om over semisolide oppervlakken te migreren. Bij onderzoeken naar geïnduceerde zwermmotiliteit kan de specifieke concentratie van een inductor mogelijk geen gebeurtenissen melden die zich voordoen binnen het optimale concentratiebereik om de gewenste reacties van een soort uit te lokken. Semisolide platen met meerdere concentraties worden vaak gebruikt om de respons binnen een inductorconcentratiebereik te onderzoeken. Afzonderlijke halfvaste platen verhogen echter de variaties in de gemiddelde viscositeit en het vochtgehalte in elke plaat als gevolg van de niet-uniforme stollingstijd.
Dit artikel beschrijft een eenstapsmethode om tegelijkertijd de zwermmotiliteit van het oppervlak te testen op een enkele gradiëntplaat, waarbij de isometrisch gerangschikte testputten de gelijktijdige verwerving van multiconcentratieresponsen mogelijk maken. In het huidige werk werd de oppervlaktezwerm van Escherichia coli K12 en Pseudomonas aeruginosa PAO1 geëvalueerd als reactie op een concentratiegradiënt van inductoren zoals resveratrol en arabinose. Periodiek werden de zwermmorfologieën in beeld gebracht met behulp van een beeldvormingssysteem om het hele oppervlaktezwermproces vast te leggen.
De kwantitatieve meting van de zwermmorfologieën werd verkregen met behulp van ImageJ-software, die analyseerbare informatie van het zwermgebied verschafte. Dit artikel presenteert een eenvoudige gradiënt zwermplaatmethode die kwalitatieve en kwantitatieve informatie biedt over de effecten van de inductoren op oppervlaktezwermen, die kan worden uitgebreid om de effecten van andere inductoren op een breder scala van beweeglijke bacteriesoorten te bestuderen.
Introduction
Bacteriële zwermmotiliteit verwijst naar de collectieve migratie van bacteriële cellen over het oppervlak van een stof. Naast semisolide agarplaten die speciaal in het laboratorium zijn bereid1, wordt dit fenotype ook waargenomen op sommige zachte substraten zoals dierlijke weefsels2, gehydrateerde oppervlakken3 en plantenwortels4. Hoewel een halfvast oppervlak wordt beschouwd als een van de fundamentele voorwaarden voor bacteriële zwermen, hebben sommige soorten ook een energierijk medium nodig om hun zwermmotiliteit te ondersteunen5. Flagellarotatie drijft zowel zwemmende als zwermende motiliteit-zwemmen beschrijft de eencellige motiliteit in een vloeibare omgeving, terwijl zwermen de synchrone beweging is van een microbiële populatie over semisolide oppervlakken.
Substraatviscositeit beïnvloedt bacteriële motiliteit; studies van pathogene microben, zoals Helicobacter pylori, hebben aangetoond dat de beweeglijkheid van de ziekteverwekker verandert afhankelijk van de viscositeit van de mucinelaag, die wordt beïnvloed door omgevingsverzuring in de menselijke gastheer6. Om deze omgevingen te repliceren, beperken eerdere studies met een agarconcentratie van meer dan 0,3% (w / v) de bacteriële zwemmotiliteit om een geleidelijke verschuiving naar oppervlaktezwermen te bewerkstelligen. Het gebruik van een agarconcentratie van meer dan 1% (w/v) voorkomt de zwermmotiliteit van veel soorten7. De koloniepatronen die op het oppervlak worden gevormd, zijn divers, waaronder featureless mat8, bull’s eye9, dendrieten10 en vortex11.
Hoewel de relevantie van dergelijke patronen onduidelijk blijft, lijken die patronen afhankelijk te zijn van omgevings- en chemische signalen12. Omgevingssignalen hebben betrekking op verschillende aspecten, waaronder temperatuur, zoutgehalte, licht en pH, terwijl chemische signalen de aanwezigheid van microbiële quorumdetectiemoleculen, biochemische bijproducten en voedingsstoffen omvatten. Auto-induceer quorum sensing signaling molecules zoals AHL (N-hexanoyl-L homoserine lacton) kunnen oppervlaktezwermen beïnvloeden door de productie van oppervlakteactieve stof13,14 te reguleren. Resveratrol, een fytoalexineverbinding, zou bacteriële zwermmotiliteit kunnen beperken15.
In het huidige werk onderzoeken we het effect van gradiëntconcentraties van resveratrol op de wild-type Escherichia coli K12-stam en onderzoeken we arabinose-induceerbare zwermmotiliteit van gemanipuleerde E. coli K12-YdeH- en Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-soorten. De productie van het YdeH-enzym wordt geïnduceerd door arabinose via de araBAD-promotor, wat resulteert in cellulaire c-di-GMP-verstoring en de bacteriële zwermmotiliteit beïnvloedt16,17. Dit induceerbare zwermgedrag wordt bestudeerd met behulp van arabinose gradiënt zwermplaten met E. coli K12-YdeH en P. aeruginosa PAO1-YdeH stammen.
De gradiëntzwermplaten worden bereid door achtereenvolgens dubbellaags medium te stollen (figuur 1B). De onderste laag bestaat uit het medium dat met de inductor is toegevoegd en aan één kant van een gestut petrischaaltje wordt gegoten. Na de stolling van de onderste laag wordt de petrischaal teruggebracht naar een plat oppervlak, waar de bovenste laag met het medium zonder de inductor vanaf de andere kant van de plaat wordt toegevoegd. Nadat de zwermplaten volledig zijn gestold, worden isometrisch gerangschikte houderputten geproduceerd door gaten op de zwermplaten te boren volgens een vaste lay-out (figuur 1C) of door de putten te bedrukken met behulp van een 3D-geprint model van het plaatdeksel met haringen tijdens het medium uithardingsproces (aanvullende figuur S1). Een gelbeeldvormingssysteem wordt gebruikt om de zwermende morfologieën op verschillende tijdstippen vast te leggen (figuur 2). Analyse van oppervlaktezwermen met behulp van ImageJ-software (aanvullende figuur S2) levert kwantitatieve resultaten op van het oppervlaktezwermproces (figuur 3).
Daarom stellen we een eenvoudige methode voor om de oppervlaktezwermmotiliteit te testen binnen een concentratiebereik van inductoren. Deze methode kan worden gebruikt om meerdere concentratieresponsen van andere inductoren te testen door de inductor in het medium van de onderste laag te mengen en kan worden toegepast op andere beweeglijke soorten (bijv. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Deze aanpak zou betrouwbare kwalitatieve en kwantitatieve resultaten kunnen opleveren voor het screenen van een enkele chemische inductor, en afzonderlijke platen kunnen worden gebruikt om meer chemische inductoren te evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onderzoek naar bacteriële zwermmotiliteit op semisolide gradiëntplaten kan een uitdagende taak zijn18,19,20, omdat het meerdere factoren omvat, zoals substraatviscositeit, vochtigheid en mediumcomponenten. Onder deze factoren speelt de agarconcentratie een beslissende rol bij het bepalen van microbiële terugkeer naar zwemmende of zwermmotiliteit. Naarmate de agarconcentratie toeneemt van 0,3% (w/v) naar 1% (w/v), zal de bacte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De ontwikkeling van deze techniek werd ondersteund door de fondsen van het National Key R & D-plan van het ministerie van Wetenschap en Technologie (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China’s Research Fund for International Young Scientists (22050410270) en Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). We willen graag onze oprechte dank uitspreken aan Miss Chen Xinyi voor haar hulp bij het proeflezen van het document en laboratoriumbeheer.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
