유도기 그라디언트 플레이트의 박테리아 표면 떼 운동성 정량화
Summary
여기에서, 우리는 박테리아 떼 운동성을 평가하면서 동시에 다중 농도 반응을 얻기 위해 유도제 구배 플레이트의 사용을 설명합니다.
Abstract
박테리아 떼 운동성은 박테리아 공동체가 반고체 표면 위로 이동하기 위해 사용하는 일반적인 미생물 표현형입니다. 유도된 떼 떼 운동성에 대한 조사에서, 유도제의 특정 농도는 종으로부터 원하는 반응을 유도하기 위해 최적의 농도 범위 내에서 발생하는 사건을 보고할 수 없을 수 있다. 다중 농도를 함유하는 반고체 플레이트는 유도제 농도 범위 내에서 반응을 조사하기 위해 일반적으로 사용된다. 그러나, 분리된 반고체 플레이트는 불균일한 응고 시간으로 인해 각 플레이트 내의 중간 점도 및 수분 함량의 변화를 증가시킨다.
이 백서에서는 등각 방식으로 배열된 테스트 웰을 통해 다농도 반응을 동시에 획득할 수 있는 단일 구배 플레이트에서 표면 떼 운동성을 동시에 테스트하는 한 단계 방법을 설명합니다. 본 연구에서, 에스케리치아 콜리 K12 및 슈도모나스 aeruginosa PAO1의 표면 떼를 레스베라트롤 및 아라비노스와 같은 유도제의 농도 구배에 반응하여 평가하였다. 주기적으로, 떼 형태학은 이미징 시스템을 사용하여 전체 표면 떼 과정을 포착하기 위해 이미징되었습니다.
떼 형태학의 정량적 측정은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 획득하여 떼 영역의 분석 가능한 정보를 제공했습니다. 이 논문은 표면 떼에 대한 유도자의 효과에 대한 질적 및 양적 정보를 제공하는 간단한 구배 떼 플레이트 방법을 제시하며, 이는 더 넓은 범위의 운동성 박테리아 종에 대한 다른 유도제의 효과를 연구하기 위해 확장 될 수 있습니다.
Introduction
박테리아 떼 운동성은 물질의 표면을 가로 질러 박테리아 세포의 집단적 이동을 말합니다. 실험실1에서 특별히 제조된 반고체 한천 플레이트 외에도, 이 표현형은 동물 조직2, 수화된 표면3 및 식물 뿌리4와 같은 일부 연질 기질에서도 관찰됩니다. 반고체 표면은 박테리아 떼의 기본 조건 중 하나로 간주되지만, 일부 종은 또한 떼를 지어 운동성을 지원하기 위해 에너지가 풍부한 배지가 필요합니다5. 편모 회전은 수영과 떼를 지어 운동성 수영을 모두 할 수있는 힘은 액체 환경 내에서 단세포 운동성을 묘사하는 반면, 떼를 지어 떼를 지어 반고체 표면을 가로 지르는 미생물 집단의 동시 이동입니다.
기질 점도는 박테리아 운동성에 영향을 미친다; 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)와 같은 병원성 미생물에 대한 연구에 따르면 인간 숙주의 환경 산성화에 의해 영향을 받는 뮤신층 점도에 따라 병원균의 운동성이 변하는 것으로 나타났다6. 이러한 환경을 복제하기 위해 0.3 % (w / v) 이상의 한천 농도를 사용한 초기 연구는 박테리아 수영 운동성을 제한하여 표면 떼로 점진적으로 이동시킵니다. 한천 농도를 1%(w/v) 이상으로 사용하면 많은 종의 떼 지어지는 운동성을 예방할 수 있습니다7. 표면에 형성된 콜로니 패턴은 특징없는 mat8, 황소의 눈9, dendrites10 및 vortex11을 포함하여 다양합니다.
이러한 패턴의 관련성은 불분명하지만, 이러한 패턴은 환경 및 화학적 단서에 의존하는 것으로 보입니다12. 환경 단서는 온도, 염분, 빛 및 pH를 포함한 다양한 측면을 포괄하는 반면, 화학적 단서에는 미생물 쿼럼 감지 분자, 생화학 부산물 및 영양소의 존재가 포함됩니다. AHL(N-헥사노일-L 호모세린 락톤)과 같은 자동 유도기 정족수 감지 신호전달 분자는 계면활성제13,14의 생산을 조절함으로써 표면 떼에 영향을 줄 수 있다. 피토알렉신 화합물인 레스베라트롤은 박테리아의 떼 지어 모이는 운동성을 제한할 수 있다15.
본 연구에서는 야생형 에스케리치아 콜라이 K12 균주에 대한 레스베라트롤의 구배 농도의 영향을 조사하고 조작된 대장균 K12-YdeH 및 슈도모나스 aeruginosa PAO1-YdeH 종의 아라비노스 유도성 떼 운동성을 조사하였다. YdeH 효소의 생산은 araBAD 프로모터를 통해 아라비노스에 의해 유도되며, 이로 인해 세포 c-di-GMP 교란이 발생하고 박테리아 떼 운동성에 영향을 미친다16,17. 이 유도성 떼 거동은 대장균 K12-YdeH 및 P. aeruginosa PAO1-YdeH 균주를 갖는 아라비노스 구배 떼 플레이트를 사용하여 연구된다.
구배 떼 플레이트는 이중층 매질을 연속적으로 고형화하여 제조된다(그림 1B). 바닥층은 유도제와 함께 첨가된 배지를 포함하며, 소품이 올라간 페트리 접시의 한쪽에 부어진다. 바닥층이 응고되면 페트리 접시는 평평한 표면으로 되돌아 가며, 여기서 유도제가없는 배지를 포함하는 상층이 플레이트의 다른면에서 추가됩니다. 떼 플레이트가 완전히 응고된 후, 등각 방향으로 배열된 홀딩 웰은 고정된 레이아웃(그림 1C)에 따라 떼 플레이트에 구멍을 뚫거나 중간 경화 공정 중에 못을 포함하는 플레이트 커버의 3D 프린팅된 모델을 사용하여 웰을 각인함으로써 생성됩니다(보충 그림 S1). 겔 이미징 시스템은 서로 다른 시점에서 떼를 지어 모은 형태를 포착하는 데 사용됩니다(그림 2). ImageJ 소프트웨어를 사용한 표면 떼 분석(보충 그림 S2)은 표면 떼 공정의 정량적 결과를 제공합니다(그림 3).
따라서, 우리는 유도제의 농도 범위 내에서 표면 떼 운동성을 테스트하는 간단한 방법을 제안합니다. 이 방법은 유도제를 바닥층 배지 내로 혼합함으로써 다른 유도제의 다중 농도 반응을 시험하는데 사용될 수 있고, 다른 운동성 종 (예를 들어, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 엔테리카, 프로테우스 미라빌리스, 예르시니아 엔테로콜리티카)에 적용될 수 있다. 이 접근법은 단일 화학 유도제를 스크리닝하기 위한 신뢰할 수 있는 정성적 및 정량적 결과를 제공할 수 있고, 더 많은 화학적 유도제를 평가하기 위해 별도의 플레이트를 사용할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
반고체 구배 플레이트에서 박테리아 떼 운동성에 대한 조사는 기판 점도, 습도 및 중간 성분과 같은 여러 요인을 포함하기 때문에 어려운 작업이 될 수 있습니다.18,19,20. 이러한 요인 중에서 한천 농도는 수영이나 떼 지어 운동성으로의 미생물 역전을 결정하는 데 결정적인 역할을합니다. 한천 농도가 0.3 % (w / v)에서 1 % (w / v)로…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 기술의 개발은 과학 기술부의 국가 핵심 R & D 계획 (2018YF0902604), 국제 젊은 과학자를위한 중국 연구 기금 (22050410270)의 국립 자연 과학 재단 및 심천 첨단 기술 연구소 외부 기금 (DWKF20190001)의 기금으로 지원되었습니다. 우리는 문서 교정 및 실험실 관리에 도움을 주신 Chen Xinyi 양에게 진심으로 감사드립니다.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
