Quantificando a motilidade de enxame de superfície bacteriana em placas de gradiente indutor
Summary
Aqui, descrevemos o uso de placas de gradiente indutor para avaliar a motilidade bacteriana, ao mesmo tempo em que obstruindo múltiplas respostas de concentração.
Abstract
A motilidade bacteriana é um fenótipo microbiológico comum que as comunidades bacterianas usam para migrar sobre superfícies semisóidas. Em investigações de motilidade induzida, a concentração específica de um indutor pode não ser capaz de relatar eventos ocorridos dentro da faixa de concentração ideal para obter as respostas desejadas de uma espécie. Placas semisóidas contendo múltiplas concentrações são comumente usadas para investigar a resposta dentro de uma faixa de concentração de indutor. No entanto, placas semisóidas separadas aumentam as variações no teor médio de viscosidade e umidade dentro de cada placa devido ao tempo de solidificação não uniforme.
Este artigo descreve um método de uma etapa para testar simultaneamente a motilidade de enxame de superfície em uma única placa de gradiente, onde os poços de teste organizados isometricamente permitem a aquisição simultânea de respostas multiconcentração. No presente trabalho, o enxame superficial de Escherichia coli K12 e Pseudomonas aeruginosa PAO1 foram avaliados em resposta a um gradiente de concentração de indutores como resveratrol e arabinose. Periodicamente, as morfologias do enxame eram imagens usando um sistema de imagem para capturar todo o processo de enxame de superfície.
A medição quantitativa das morfologias do enxame foi adquirida por meio do software ImageJ, fornecendo informações analisáveis da área do enxame. Este artigo apresenta um método simples de placa de enxame gradiente que fornece informações qualitativas e quantitativas sobre os efeitos dos indutores sobre o enxame superficial, que podem ser estendidos para estudar os efeitos de outros indutores em uma gama mais ampla de espécies bacterianas motile.
Introduction
A motilidade bacteriana refere-se à migração coletiva de células bacterianas através da superfície de uma substância. Além das placas de ágar semisóidas especialmente preparadas em laboratório1, este fenótipo também é observado em alguns substratos macios, como tecidos animais2, superfícies hidratadas3 e raízes vegetais4. Embora uma superfície semisóida seja considerada uma das condições fundamentais para o enxame bacteriano, algumas espécies também requerem um meio rico em energia para apoiar sua motilidade em enxame5. A rotação flagela alimenta tanto a natação quanto a motilidade-natação infestada descreve a motilidade unicelular dentro de um ambiente líquido, enquanto o enxame é o movimento síncrona de uma população microbiana através de superfícies semisócidas.
A viscosidade substrato influencia a motilidade bacteriana; estudos de micróbios patogênicos, como Helicobacter pylori, mostraram que a motilidade do patógeno muda dependendo da viscosidade da camada de mucina, que é influenciada pela acidificação ambiental no hospedeiro humano6. Para replicar esses ambientes, estudos anteriores usando concentração de ágar acima de 0,3% (w/v) restringem a motilidade da natação bacteriana para efetuar uma mudança gradual no enxame de superfície. O uso da concentração de ágar acima de 1% (c/v) impede a motilidade de muitas espécies7. Os padrões da colônia formados na superfície são diversos, incluindo tapete sem características, olho de touro9, dendritos10 e vórtice11.
Embora a relevância desses padrões ainda não esteja clara, esses padrões parecem depender de pistas ambientais e químicas12. As pistas ambientais abrangem diferentes aspectos, incluindo temperatura, salinidade, luz e pH, enquanto as pistas químicas incluem a presença de moléculas sensoriais de quórum microbiano, subprodutos bioquímicos e nutrientes. O quórum de autoindutores que detectam moléculas de sinalização como a AHL (N-hexanoyl-L homoserina lactona) pode impactar o enxame de superfície, regulando a produção de surfactante13,14. Resveratrol, um composto de fitoalexina, poderia restringir a motilidade bacteriana 15.
No presente trabalho, investigamos o efeito das concentrações gradientes de resveratrol na cepa Escherichia coli K12 do tipo selvagem e investigamos a motilidade de enxame arabinose da espécie E. coli K12-YdeH e Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. A produção da enzima YdeH é induzida por arabinose através do promotor araBAD, resultando em perturbação c-di-GMP celular e afetando motilidade bacteriana 16,17. Este comportamento de enxame indutível é estudado usando placas de enxame de gradiente arabinose com cepas E. coli K12-YdeH e P. aeruginosa PAO1-YdeH.
As placas de enxame de gradiente são preparadas solidificando sucessivamente o meio de dupla camada (Figura 1B). A camada inferior compreende o meio adicionado com o indutor, derramado em um lado de uma placa de Petri apoiada. Após a solidificação da camada inferior, a placa de Petri é devolvida a uma superfície plana, onde a camada superior contendo o meio sem o indutor é adicionada do outro lado da placa. Depois que as placas de enxame são completamente solidificadas, os poços de retenção isometricamente organizados são produzidos por furos chatos nas placas do enxame seguindo um layout fixo (Figura 1C) ou imprimindo os poços usando um modelo impresso em 3D da tampa da placa contendo pinos durante o processo de cura média (Figura Suplementar S1). Um sistema de imagem em gel é usado para capturar as morfologias em diferentes pontos de tempo (Figura 2). A análise do enxame de superfície usando o software ImageJ (Figura Suplementar S2) fornece resultados quantitativos do processo de enxame de superfície (Figura 3).
Assim, propomos um método simples para testar a motilidade de enxame de superfície dentro de uma faixa de concentração de indutores. Este método pode ser usado para testar múltiplas respostas de concentração de outros indutores misturando o indutor no meio de camada inferior e pode ser aplicado a outras espécies motile (por exemplo, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Esta abordagem poderia fornecer resultados qualitativos e quantitativos confiáveis para a triagem de um único indutor químico, e placas separadas podem ser empregadas para avaliar mais indutores químicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A investigação da motilidade bacteriana em placas de gradiente semisólidas pode ser uma tarefa desafiadora18,19,20, pois envolve múltiplos fatores como viscosidade substrato, umidade e componentes médios. Entre esses fatores, a concentração de ágar desempenha um papel decisivo na determinação da reversão microbiana à motilidade da natação ou do enxame. À medida que a concentração de ágar aumenta de 0,3% (w/v) p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O desenvolvimento dessa técnica foi apoiado pelos recursos do plano Nacional de P&D do Ministério da Ciência e Tecnologia (2018YF0902604), da National Natural Science Foundation of China’s Research Fund for International Young Scientists (22050410270) e do Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Gostaríamos de oferecer nossa sincera gratidão à Srta. Chen Xinyi por sua ajuda na revisão do documento e da gestão laboratorial.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
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