Gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening zur Identifizierung von Faktoren, die einen Phänotyp der Arzneimittelresistenz modulieren
Summary
Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).
Abstract
Das Verständnis klinisch relevanter Treibermechanismen der erworbenen Chemoresistenz ist entscheidend für die Aufklärung von Möglichkeiten zur Umgehung von Resistenzen und zur Verbesserung des Überlebens bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML). Ein kleiner Teil der leukämischen Zellen, die eine Chemotherapie überleben, haben einen ausgeglichenen epigenetischen Zustand, um chemotherapeutische Beleidigungen zu tolerieren. Eine weitere Exposition gegenüber einer Chemotherapie ermöglicht es diesen Wirkstoffpersisterzellen, einen festen epigenetischen Zustand zu erreichen, der zu einer veränderten Genexpression führt, was zur Proliferation dieser arzneimittelresistenten Populationen und schließlich zu einem Rückfall oder einer refraktären Erkrankung führt. Daher ist die Identifizierung epigenetischer Modulationen, die das Überleben arzneimittelresistenter leukämischer Zellen erfordern, von entscheidender Bedeutung. Wir beschreiben ein Protokoll zur Identifizierung epigenetischer Modulatoren, die die Resistenz gegen das Nukleosidanalog-Cytarabin (AraC) vermitteln, indem wir ein gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening in einer erworbenen Cytarabin-resistenten AML-Zelllinie verwenden. Die Bibliothek besteht aus 5.485 shRNA-Konstrukten, die auf 407 humane epigenetische Faktoren abzielen, was ein epigenetisches Faktor-Screening mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Introduction
Die therapeutischen Optionen bei akuter myeloischer Leukämie (AML) sind in den letzten fünf Jahrzehnten unverändert geblieben, wobei Cytarabin (AraC) und Anthrazykline die Eckpfeiler für die Behandlung der Krankheit sind. Eine der Herausforderungen für den Erfolg der AML-Therapie ist die Resistenz von leukämischen Stammzellen gegen Chemotherapie, was zu einem Krankheitsrückfall führt 1,2. Die epigenetische Regulation spielt eine entscheidende Rolle bei der Krebspathogenese und Arzneimittelresistenz, und mehrere epigenetische Faktoren haben sich als vielversprechende therapeutische Zieleherauskristallisiert 3,4,5. Epigenetische Regulationsmechanismen beeinflussen die Proliferation und das Überleben unter kontinuierlicher Exposition gegenüber Chemotherapeutika. Studien zu nicht-hämatologischen Malignomen haben berichtet, dass ein kleiner Teil der Zellen, die die Arzneimittelwirkung überwinden, verschiedene epigenetische Modifikationen erfahren, was zum Überleben dieser Zellen führt 6,7. Die Rolle epigenetischer Faktoren bei der Vermittlung erworbener Resistenzen gegen Cytarabin bei AML wurde jedoch nicht untersucht.
Hochdurchsatz-Screening ist ein Ansatz zur Wirkstoffforschung, der im Laufe der Zeit an globaler Bedeutung gewonnen hat und in verschiedenen Aspekten zu einer Standardmethode geworden ist, um potenzielle Ziele in zellulären Mechanismen, für die Signalwegprofilierung und auf molekularer Ebenezu identifizieren 8,9. Das Konzept der synthetischen Letalität beinhaltet die Interaktion zwischen zwei Genen, bei denen die Störung eines der beiden Gene allein lebensfähig ist, aber von beiden Genen gleichzeitig zum Verlust der Lebensfähigkeitführt 10. Die Nutzung der synthetischen Letalität in der Krebsbehandlung könnte dazu beitragen, robuste synthetische letale genetische Interaktionen zu identifizieren und mechanistisch zu charakterisieren11. Wir haben einen kombinatorischen Ansatz des Hochdurchsatz-shRNA-Screenings mit synthetischer Letalität gewählt, um die epigenetischen Faktoren zu identifizieren, die für die erworbene Cytarabinresistenz bei AML verantwortlich sind.
Es ist bekannt, dass akute Leukämien, die durch chromosomale Translokation des Mixed-Lineage-Leukämiegens (MLL oder KMT2A) verursacht werden, bei Patienten mit einem schlechten Überleben verbunden sind. Die resultierenden chimären Produkte von MLL-Genumlagerungen, d.h. MLL-Fusionsproteine (MLL-FPs), können hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs) unter Beteiligung mehrerer epigenetischer Faktoren in leukämische Blasten umwandeln. Diese epigenetischen Regulatoren bilden ein kompliziertes Netzwerk, das die Aufrechterhaltung des Leukämieprogramms diktiert und daher potenzielle therapeutische Ziele bilden könnte. In diesem Zusammenhang verwendeten wir die MV4-11-Zelllinie (die das MLL-Fusionsgen MLL-AF4 mit der FLT3-ITD-Mutation beherbergt; als MV4-11 P bezeichnet), um die erworbene Cytarabin-resistente Zelllinie zu entwickeln, die als MV4-11 AraC R bezeichnet wird. Die Zelllinie wurde steigenden Dosen von Cytarabin mit intermittierender Erholung von der medikamentösen Behandlung, bekannt als Drogenurlaub, ausgesetzt. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) wurde mittels In-vitro-Zytotoxizitätstest bewertet.
Wir verwendeten die gepoolte epigenetische shRNA-Bibliothek (siehe Materialverzeichnis), die vom hEF1a-Promotor mit einem lentiviralen pZIP-Backbone gesteuert wurde. Diese Bibliothek umfasst shRNAs, die auf 407 epigenetische Faktoren abzielen. Jeder Faktor hat 5-24 shRNAs, mit insgesamt 5.485 shRNAs, einschließlich fünf Nicht-Targeting-Kontroll-shRNAs. Das modifizierte miR-30-Gerüst “UltrmiR” wurde für eine effiziente primäre shRNA-Biogenese und -Expressionoptimiert 12,13.
Der Umriss dieses Experiments ist in Abbildung 1A dargestellt. Das aktuelle Protokoll konzentriert sich auf das RNAi-Screening unter Verwendung der epigenetischen Faktor-shRNA-Bibliothek in der MV4-11 AraC R-Zelllinie (Abbildung 1B), einer Suspensionszelllinie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um jede Zielbibliothek in jeder arzneimittelresistenten Zelllinie der eigenen Wahl zu überprüfen. Es sollte beachtet werden, dass das Transduktionsprotokoll für adhärente Zellen unterschiedlich sein wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-Interferenz (RNAi) wird in großem Umfang für funktionelle Genomik-Studien verwendet, die siRNA- und shRNA-Screening umfassen. Der Vorteil von shRNA besteht darin, dass sie in Plasmidvektoren eingebaut und in genomische DNA integriert werden können, was zu einer stabilen Expression und damit zu einem längeren Knockdown der Ziel-mRNA führt. Ein gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening ist im Vergleich zu den herkömmlichen Array-Screens (siRNA) robust und kostengünstig. Die Identifizierung der Wesentlichkeit einer be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wird zum Teil durch einen Zuschuss des Department of Biotechnology BT/PR8742/AGR/36/773/2013 an SRV finanziert; und Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 und Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 bis P.B. RVS und P.B. werden von Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 bzw. IA/S/15/1/501842 unterstützt. S.D. wird durch das CSIR-UGC-Stipendium unterstützt, und S.I. wird durch ein ICMR-Senior-Forschungsstipendium unterstützt. Wir danken Abhirup Bagchi, Sandya Rani und den Mitarbeitern der CSCR Flow Cytometry Core Facility für ihre Hilfe. Wir danken MedGenome Inc. auch für die Unterstützung bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung und Datenanalyse.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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