Samlet shRNA-bibliotekscreening for å identifisere faktorer som modulerer en legemiddelresistensfenotype
Summary
RNAi-screening (High-throughput RNA interference) ved hjelp av et basseng med lentivirale shRNAer kan være et verktøy for å oppdage terapeutisk relevante syntetiske dødelige mål i maligniteter. Vi tilbyr en samlet shRNA screening tilnærming for å undersøke epigenetiske effektorer i akutt myeloid leukemi (AML).
Abstract
Å forstå klinisk relevante førermekanismer for ervervet kjemoresistens er avgjørende for å belyse måter å omgå resistens og forbedre overlevelsen hos pasienter med akutt myeloid leukemi (AML). En liten brøkdel av leukemiske celler som overlever kjemoterapi har en klar epigenetisk tilstand for å tolerere kjemoterapeutisk fornærmelse. Ytterligere eksponering for kjemoterapi gjør at disse stoffets utholdenhetsceller oppnår en fast epigenetisk tilstand, noe som fører til endret genuttrykk, noe som resulterer i spredning av disse legemiddelresistente populasjonene og til slutt tilbakefall eller refraktær sykdom. Derfor er det viktig å identifisere epigenetiske moduler som nødvendiggjør overlevelsen av legemiddelresistente leukemiske celler. Vi beskriver en protokoll for å identifisere epigenetiske modulatorer som formidler motstand mot nukleoside analog cytarabin (AraC) ved hjelp av samlet shRNA-bibliotekscreening i en ervervet cytarabinresistent AML-cellelinje. Biblioteket består av 5485 shRNA-konstruksjoner rettet mot 407 humane epigenetiske faktorer, noe som muliggjør epigenetisk faktorscreening med høy gjennomstrømning.
Introduction
Terapeutiske alternativer i akutt myeloid leukemi (AML) har vært uendret i nesten de siste fem tiårene, med cytarabin (AraC) og antracykliner som hjørnestein for behandling av sykdommen. En av utfordringene med suksessen med AML-terapi er motstanden av leukemiske stamceller mot kjemoterapi, noe som fører til tilbakefall av sykdommer 1,2. Epigenetisk regulering spiller en viktig rolle i kreftpatogenese og legemiddelresistens, og flere epigenetiske faktorer har dukket opp som lovende terapeutiske mål 3,4,5. Epigenetiske regulatoriske mekanismer påvirker spredning og overlevelse under kontinuerlig eksponering for kjemoterapeutiske legemidler. Studier på ikke-hematologiske maligniteter har rapportert at en liten brøkdel av cellene som overvinner legemiddeleffekten gjennomgår ulike epigenetiske modifikasjoner, noe som resulterer i disse cellenes overlevelse 6,7. Imidlertid har rollen som epigenetiske faktorer i mediering oppnådd motstand mot cytarabin i AML ikke blitt utforsket.
Screening med høy gjennomstrømning er en tilnærming til narkotikaoppdagelse som har fått global betydning over tid og har blitt en standardmetode i ulike aspekter for å identifisere potensielle mål i cellulære mekanismer, for veiprofilering og på molekylært nivå 8,9. Det syntetiske dødelighetskonseptet innebærer samspillet mellom to gener der perturbasjonen av et av genene alene er levedyktig, men av begge genene resulterer samtidig i tap av levedyktighet10. Utnyttelse av syntetisk dødelighet i kreftbehandling kan bidra til å identifisere og mekanistisk karakterisere robuste syntetiske dødelige genetiske interaksjoner11. Vi har tatt i bruk en kombinatorisk tilnærming til shRNA-screening med høy gjennomstrømning med syntetisk dødelighet for å identifisere de epigenetiske faktorene som er ansvarlige for ervervet cytarabinresistens i AML.
Akutte leukemier drevet av kromosomal translokasjon av det blandede slekts leukemigenet (MLL eller KMT2A) er kjent for å være forbundet med dårlig overlevelse hos pasienter. De resulterende chimeriske produktene av MLL-genomorganiseringer, det vil si MLL-fusjonsproteiner (MLL-FPs), kan forvandle hematopoietiske stamceller / stamceller (HSPCer) til leukemiske eksplosjoner med involvering av flere epigenetiske faktorer. Disse epigenetiske regulatorene utgjør et komplisert nettverk som dikterer vedlikehold av leukemiprogrammet og derfor kan danne potensielle terapeutiske mål. I denne sammenhengen brukte vi MV4-11-cellelinjen (som huser MLL-fusjonsgenet MLL-AF4 med FLT3-ITD-mutasjonen; betegnet som MV4-11 P) for å utvikle den oppkjøpte cytarabineresistente cellelinjen, betegnet som MV4-11 AraC R. Cellelinjen ble utsatt for økende doser cytarabin med periodisk utvinning fra medikamentbehandlingen, kjent som en narkotikaferie. Den halvmaksimale hemmende konsentrasjonen (IC50) ble vurdert ved in vitro cytotoksisitetsanalyse.
Vi brukte det samlede epigenetiske shRNA-biblioteket (se Materialtabell) drevet av hEF1a-promotoren med en pZIP lentiviral ryggrad. Dette biblioteket består av shRNAer rettet mot 407 epigenetiske faktorer. Hver faktor har 5-24 shRNAer, med totalt 5485 shRNAer, inkludert fem ikke-målrettede kontroll shRNAer. Det modifiserte “UltrmiR” miR-30 stillaset er optimalisert for effektiv primær shRNA biogenese og uttrykk12,13.
Omrisset av dette eksperimentet er illustrert i figur 1A. Den nåværende protokollen fokuserer på RNAi-screening ved hjelp av det epigenetiske faktor shRNA-biblioteket i cellelinjen MV4-11 AraC R (figur 1B), en fjæringscellelinje. Denne protokollen kan brukes til å screene ethvert målrettet bibliotek i en hvilken som helst stoffresistent cellelinje etter eget valg. Det skal bemerkes at transduksjonsprotokollen vil være forskjellig for tilhengerceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-interferens (RNAi) brukes mye til funksjonelle genomikkstudier, som inkluderer siRNA- og shRNA-screening. Fordelen med shRNA er at de kan innlemmes i plasmidvektorer og integreres i genomisk DNA, noe som resulterer i stabilt uttrykk og dermed mer langvarig nedslag av målet mRNA. En samlet shRNA-bibliotekscreening er robust og kostnadseffektiv sammenlignet med de konvensjonelle arrayed-skjermene (siRNA). Å identifisere nødvendigheten av en bestemt klasse proteiner i en genom-bred skjerm kan være tungvint. Målrett…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien er delvis finansiert av et Institutt for bioteknologistipend BT/PR8742/AGR/36/773/2013 til SRV; og Institutt for bioteknologi India BT/COE/34/SP13432/2015 og Institutt for vitenskap og teknologi, India: EMR/2017/003880 til P.B. RVS og P.B. støttes av Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 og IA/S/15/1/501842. S.D. støttes av CSIR-UGC-stipendet, og S.I. støttes av et ICMR seniorstipendiat. Vi takker Abhirup Bagchi, Sandya Rani og CSCR Flow Cytometry Core Facility ansatte for deres hjelp. Vi takker også MedGenome Inc. for å ha hjulpet til med sekvensering og dataanalyse med høy gjennomstrømning.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
