렌티바이러스 shRNA의 풀을 이용한 고처리량 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 악성종양에서 치료적으로 관련된 합성 치사적 표적을 검출하는 도구가 될 수 있다. 우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 후성 유전 학적 이펙터를 조사하기 위해 풀링 된 shRNA 스크리닝 접근법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
후천성 화학저항성의 임상적으로 관련된 동인 메커니즘을 이해하는 것은 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 저항성을 우회하고 생존을 향상시키는 방법을 밝히는 데 매우 중요합니다. 화학 요법에서 살아남은 백혈병 세포의 작은 부분은 화학 요법 모욕을 용인 할 수있는 후성 유전 학적 상태를 가지고 있습니다. 화학 요법에 대한 추가 노출은 이러한 약물 지속성 세포가 고정 된 후성 유전 적 상태에 도달 할 수있게하여 유전자 발현을 변경시켜 이러한 약물 내성 집단의 증식을 초래하고 결국 재발 또는 불응성 질환을 초래합니다. 따라서 약물 내성 백혈병 세포의 생존을 필요로하는 후성 유전 적 조절을 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 획득된 시타라빈 내성 AML 세포주에서 스크리닝된 풀링된 shRNA 라이브러리를 사용하여 뉴클레오시드 유사체 시타라빈(AraC)에 대한 내성을 매개하는 후성유전학적 조절제를 확인하기 위한 프로토콜을 상세히 기술한다. 이 라이브러리는 407개의 인간 후성유전학적 인자를 표적으로 하는 5,485개의 shRNA 구축물로 구성되며, 이는 고처리량 후성유전학적 인자 스크리닝을 가능하게 한다.
서론
급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료 옵션은 시타라빈 (AraC)과 안트라 사이클린이 질병 치료의 초석으로 삼아 거의 지난 XNUMX 년 동안 변하지 않았습니다. AML 요법의 성공에 대한 도전 중 하나는 백혈병 줄기 세포가 화학 요법에 저항하여 질병 재발 1,2로 이어지는 것입니다. 후성유전학적 조절은 암 발병기전과 약물 내성에 중요한 역할을 하며, 몇 가지 후성유전학적 요인들이 유망한 치료 표적으로 부상했다 3,4,5. 후성유전학적 조절 기전은 화학요법 약물에 대한 지속적인 노출하에서 증식 및 생존에 영향을 미친다. 비 혈액 학적 악성 종양에 대한 연구에 따르면 약물 효과를 극복 한 세포의 작은 부분이 다양한 후성 유전학 변형을 거쳐 그 세포의 생존 6,7을 초래한다고보고했습니다. 그러나, AML에서 시타라빈에 대한 후천적 내성을 매개하는 후성유전학적 요인의 역할은 탐구되지 않았다.
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프로토콜
IBSC(Institutional Biosafety Committee) 지침을 따르고 렌티바이러스(BSL-2)를 처리하기 위해 적절한 시설을 사용하십시오. 직원은 렌티 바이러스의 취급 및 처분에 대해 적절하게 훈련되어야합니다. 이 프로토콜은 Vellore의 Christian Medical College의 생물 안전 지침을 따릅니다.
1. shRNAs의 지속적이고 장기간의 발현을 얻기 위한 가장 강력한 프로모터의 선택
참고: 실험을 위해 선택된 세포주에서 shRNAs의 안정적이고 장기적인 발현을 제공하는 프로모터를 확인하기 위해 형광 단백질을 발현하는 상이한 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입 실험을 수행하는 것이 필수적이다. 이러한 목적을 위해 가장 일반적으로 사용되는 프로모터는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 hEF1α (인간 신장 인자 1α), hCMV (인간 거대 세포 메갈로바이러스) 및 SSFV (비장 초점 형성 바이러스) 프로모터입니다 (도 2A).
- 트리판 블루 제외 방법을 사용하여 셀 카운트를 수행하십시오. MV4-11 AraC R 세포를 8 μg/mL 폴리....
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결과
전체 스크리닝 워크플로우는 도 1A에 묘사되어 있다. MV4-11의 시험관내 세포독성은 AraC R(48h)이 MV4-11 AraCR에서 시타라빈에 대한 IC50이 MV4-11P보다 높은 것으로 나타났다(도 1B). 이 세포주는 시타라빈 내성을 담당하는 후성유전학적 인자를 스크리닝하기 위한 모델로서 연구에 사용되었다.
도 2A는 UltramiR 서열 내에서 스크램블링된 shRNA와 함께 hEF1α (인간 신장 인자 1α), hCMV (인간 사이토메갈로바이러스) 및 SSFV (비장 초점 형성 바이러스)의 세 가지 상이한 프로모터와 함께 선형화된 pZIP 벡터 맵을 보여준다. 도 2B 는 hEF1a 프로모터에 의해 구동되는 선.......
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토론
RNA 간섭 (RNAi)은 siRNA 및 shRNA 스크리닝을 포함하는 기능적 유전체학 연구에 광범위하게 사용됩니다. shRNA의 이점은 이들이 플라스미드 벡터에 혼입되어 게놈 DNA에 통합될 수 있고, 따라서 표적 mRNA의 안정한 발현 및 따라서 보다 연장된 녹다운을 초래할 수 있다는 것이다. 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝은 기존의 어레이 스크린(siRNA)에 비해 견고하고 비용 효율적이다. 게놈 전체 스크린에서 특정 부류의 단백질의 본질성을 확인하는 것은 번거로울 수 있다. 표적화된 스크리닝 접근법은 감소된 잡음과 함께 특정 클래스 내에서 암 세포 생존 또는 약물 내성에 대한 개별 단백질의 본질성을 드러낼 수 있다. 이 프로토콜은 후성유전학적 인자의 RNAi 스크린을 강조하여 필수 유전자와 비필수 유전자를 체계적으로 모두 조사하며, AML 약물 내성을 담당하는 표적을 식별할 수 있는 기능적 플랫폼으로서 이 접근법의 사용을 입증한다.
이 강력한 기술은 실험의 설계 및 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이없고 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 SRV에 BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013 생명 공학부 보조금에 의해 부분적으로 자금을 지원합니다. 인도 BT/COE/34/SP13432/2015 및 인도 과학기술부: EMR/2017/003880 ~ P.B. RVS 및 P.B.는 Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 및 IA/S/15/1/501842에서 각각 지원합니다. S.D.는 CSIR-UGC 펠로우십의 지원을 받으며, S.I.는 ICMR 선임 연구 펠로우십의 지원을 받습니다. Abhirup Bagchi, Sandya Rani 및 CSCR Flow Cytometry Core Facility 직원에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 또한 고처리량 시퀀싱 및 데이터 분석을 도와준 MedGenome Inc.에게도 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| 100 bp 사다리 하이퍼 사다리 | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb 사다리 하이퍼 사다리 | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| 베타인(5mM) | 시그마 | B03001VL | |
| 붕산 | 퀄리겐 | 12005 | |
| 세포 배양 플라스틱 용기 | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | ||
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| 소 태아 세럼 | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR 정제 키트 | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco-RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| 빙하 아세트산 | 열 | Q11007 | |
| hCMV GFP 플라스미드 | 트랜오믹스 | 트랜스오믹스 프로모터 선택 키트 | |
| hEF1a GFPlasmid | 트랜오믹스 | 트랜스오믹스 프로모터 선택 키트 | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 세포주 | ATCC | CCL-240 | |
| KOD 핫 스타트 중합효소 | Merck | 71086 | |
| Molm13 세포주 | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 세포주 | ATCC | CRL-9591 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | ||
| psPAX2 및 pMD2.G | Addgene | Addgene 플라스미드 no.12260 & Addgene 플라스미드 번호 12259 | |
| Qubit dsDNA HS 어세이 키트 | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP 플라스미드 | 트랜오믹스 | 트랜스오믹스 프로모터 선택 키트 | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA 라이브러리 트랜 | 믹스 트랜오믹스 | Cat No. TLH UD7409; 로트 번호: A116. V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | 카탈로그 번호: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| 울트라 원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc 이미징 시스템 ( Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
참고문헌
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(201....
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재인쇄 및 허가
