Cribado agrupado de la biblioteca de shRNA para identificar los factores que modulan un fenotipo de resistencia a los medicamentos
Summary
El cribado de interferencia de ARN (ARNi) de alto rendimiento utilizando un grupo de shRNAs lentivirales puede ser una herramienta para detectar dianas letales sintéticas terapéuticamente relevantes en neoplasias malignas. Proporcionamos un enfoque de detección de ARNt agrupado para investigar los efectores epigenéticos en la leucemia mieloide aguda (LMA).
Abstract
Comprender los mecanismos impulsores clínicamente relevantes de la quimiorresistencia adquirida es crucial para dilucidar las formas de eludir la resistencia y mejorar la supervivencia en pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA). Una pequeña fracción de las células leucémicas que sobreviven a la quimioterapia tienen un estado epigenético preparado para tolerar el insulto quimioterapéutico. La exposición adicional a la quimioterapia permite que estas células persistentes de medicamentos alcancen un estado epigenético fijo, lo que conduce a una expresión génica alterada, lo que resulta en la proliferación de estas poblaciones resistentes a los medicamentos y, finalmente, en una recaída o enfermedad refractaria. Por lo tanto, es fundamental identificar las modulaciones epigenéticas que requieren la supervivencia de las células leucémicas resistentes a los medicamentos. Detallamos un protocolo para identificar moduladores epigenéticos que median la resistencia a la citarabina analógica de nucleósidos (AraC) utilizando el cribado de la biblioteca de SHRNA agrupado en una línea celular de LMA adquirida resistente a la citarabina. La biblioteca consta de 5.485 construcciones de shRNA dirigidas a 407 factores epigenéticos humanos, lo que permite la detección del factor epigenético de alto rendimiento.
Introduction
Las opciones terapéuticas en la leucemia mieloide aguda (LMA) se han mantenido sin cambios durante casi las últimas cinco décadas, con la citarabina (AraC) y las antraciclinas como la piedra angular para el tratamiento de la enfermedad. Uno de los desafíos para el éxito de la terapia con LMA es la resistencia de las células madre leucémicas a la quimioterapia, lo que lleva a la recaída de la enfermedad 1,2. La regulación epigenética juega un papel vital en la patogénesis del cáncer y la resistencia a los medicamentos, y varios factores epigenéticos han surgido como objetivos terapéuticos prometedores 3,4,5. Los mecanismos reguladores epigenéticos afectan la proliferación y la supervivencia bajo la exposición continua a fármacos quimioterapéuticos. Los estudios en neoplasias malignas no hematológicas han informado que una pequeña fracción de células que superan el efecto del fármaco sufren diversas modificaciones epigenéticas, lo que resulta en la supervivencia de esas células 6,7. Sin embargo, no se ha explorado el papel de los factores epigenéticos en la mediación de la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA.
El cribado de alto rendimiento es un enfoque para el descubrimiento de fármacos que ha ganado importancia global con el tiempo y se ha convertido en un método estándar en diferentes aspectos para identificar objetivos potenciales en mecanismos celulares, para el perfil de vías y a nivel molecular 8,9. El concepto de letalidad sintética implica la interacción entre dos genes donde la perturbación de cualquiera de los genes por sí sola es viable, pero de ambos genes simultáneamente resulta en la pérdida de viabilidad10. Explotar la letalidad sintética en el tratamiento del cáncer podría ayudar a identificar y caracterizar mecánicamente interacciones genéticas letales sintéticas robustas11. Hemos adoptado un enfoque combinatorio de cribado de shRNA de alto rendimiento con letalidad sintética para identificar los factores epigenéticos responsables de la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA.
Se sabe que las leucemias agudas impulsadas por la translocación cromosómica del gen de la leucemia de linaje mixto (MLL o KMT2A) se asocian con una supervivencia deficiente en los pacientes. Los productos quiméricos resultantes de los reordenamientos del gen MLL , es decir, las proteínas de fusión MLL (MLL-FPs), pueden transformar las células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en blastos leucémicos con la participación de múltiples factores epigenéticos. Estos reguladores epigenéticos constituyen una red complicada que dicta el mantenimiento del programa de leucemia y, por lo tanto, podrían formar potenciales dianas terapéuticas. En este contexto, utilizamos la línea celular MV4-11 (que alberga el gen de fusión MLL MLL-AF4 con la mutación FLT3-ITD; denominada MV4-11 P) para desarrollar la línea celular resistente a la citarabina adquirida, denominada MV4-11 AraC R. La línea celular fue expuesta a dosis crecientes de citarabina con recuperación intermitente del tratamiento farmacológico, conocido como vacaciones de drogas. La concentración inhibitoria medio máxima (IC50) se evaluó mediante ensayo de citotoxicidad in vitro .
Se utilizó la biblioteca de shRNA epigenética agrupada (ver Tabla de Materiales) impulsada por el promotor hEF1a con una columna vertebral lentiviral pZIP. Esta biblioteca comprende shRNAs dirigidos a 407 factores epigenéticos. Cada factor tiene de 5 a 24 shRNAs, con un total de 5.485 shRNAs, incluyendo cinco shRNAs de control no objetivo. El andamio miR-30 “UltrmiR” modificado ha sido optimizado para una biogénesis y expresión eficientes de shRNA primario12,13.
El esquema de este experimento se ilustra en la Figura 1A. El protocolo actual se centra en el cribado de ARNi utilizando la biblioteca de ARNt shRNA del factor epigenético en la línea celular MV4-11 AraC R (Figura 1B), una línea celular en suspensión. Este protocolo se puede utilizar para examinar cualquier biblioteca dirigida en cualquier línea celular resistente a los medicamentos de su elección. Cabe señalar que el protocolo de transducción será diferente para las células adherentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La interferencia de ARN (ARNi) se utiliza ampliamente para estudios de genómica funcional, que incluyen la detección de siRNA y shRNA. El beneficio de los shRNA es que pueden incorporarse a vectores plásmidos e integrarse en el ADN genómico, lo que resulta en una expresión estable y, por lo tanto, un derribo más prolongado del ARNm objetivo. Un cribado de biblioteca de shRNA agrupado es robusto y rentable en comparación con los cribados convencionales (siRNA). Identificar la esencialidad de una clase específica d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio está financiado en parte por una subvención del Departamento de Biotecnología BT/PR8742/AGR/36/773/2013 a SRV; y Departamento de Biotecnología de la India BT/COE/34/SP13432/2015 y Departamento de Ciencia y Tecnología de la India: EMR/2017/003880 a P.B. RVS y P.B. cuentan con el apoyo de Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842, respectivamente. S.D. cuenta con el apoyo de la beca CSIR-UGC, y S.I. cuenta con el apoyo de una beca de investigación senior de ICMR. Agradecemos a Abhirup Bagchi, Sandya Rani y al personal de CSCR Flow Cytometry Core Facility por su ayuda. También agradecemos a MedGenome Inc. por ayudar con la secuenciación de alto rendimiento y el análisis de datos.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
