Poolad shRNA-biblioteksscreening för att identifiera faktorer som modulerar en läkemedelsresistensfenotyp
Summary
RNA-interferens (RNAi) screening med hög genomströmning med hjälp av en pool av lentivirala shRNA kan vara ett verktyg för att detektera terapeutiskt relevanta syntetiska dödliga mål vid maligniteter. Vi tillhandahåller en poolad shRNA-screeningmetod för att undersöka de epigenetiska effektorerna vid akut myeloisk leukemi (AML).
Abstract
Att förstå kliniskt relevanta drivkraftsmekanismer för förvärvad kemoresistens är avgörande för att belysa sätt att kringgå resistens och förbättra överlevnaden hos patienter med akut myeloisk leukemi (AML). En liten del av leukemiska celler som överlever kemoterapi har ett redo epigenetiskt tillstånd för att tolerera kemoterapeutisk förolämpning. Ytterligare exponering för kemoterapi gör det möjligt för dessa läkemedelsbeständiga celler att uppnå ett fast epigenetiskt tillstånd, vilket leder till förändrat genuttryck, vilket resulterar i spridning av dessa läkemedelsresistenta populationer och så småningom återfall eller eldfast sjukdom. Därför är det viktigt att identifiera epigenetiska moduleringar som kräver överlevnad av läkemedelsresistenta leukemiska celler. Vi beskriver ett protokoll för att identifiera epigenetiska modulatorer som förmedlar resistens mot nukleosidanalog cytarabin (AraC) med hjälp av poolad shRNA-biblioteksscreening i en förvärvad cytarabinresistent AML-cellinje. Biblioteket består av 5 485 shRNA-konstruktioner riktade mot 407 humana epigenetiska faktorer, vilket möjliggör epigenetisk faktorscreening med hög genomströmning.
Introduction
Terapeutiska alternativ vid akut myeloisk leukemi (AML) har varit oförändrade under nästan de senaste fem decennierna, med cytarabin (AraC) och antracykliner som hörnstenen för behandling av sjukdomen. En av utmaningarna för framgången med AML-terapi är leukemiska stamcellers resistens mot kemoterapi, vilket leder till sjukdomsåterfall 1,2. Epigenetisk reglering spelar en viktig roll i cancerpatogenes och läkemedelsresistens, och flera epigenetiska faktorer har framkommit som lovande terapeutiska mål 3,4,5. Epigenetiska regleringsmekanismer påverkar proliferation och överlevnad under kontinuerlig exponering för kemoterapeutiska läkemedel. Studier av icke-hematologiska maligniteter har rapporterat att en liten del av cellerna som övervinner läkemedelseffekten genomgår olika epigenetikmodifieringar, vilket resulterar i dessa cellers överlevnad 6,7. Emellertid, den roll som epigenetiska faktorer spelar för att förmedla förvärvad resistens mot cytarabin i AML har inte undersökts.
Screening med hög genomströmning är ett tillvägagångssätt för läkemedelsupptäckt som har fått global betydelse över tid och har blivit en standardmetod i olika aspekter för att identifiera potentiella mål i cellulära mekanismer, för vägprofilering och på molekylär nivå 8,9. Det syntetiska dödlighetskonceptet involverar interaktionen mellan två gener där störningen av endera genen ensam är livskraftig men av båda generna samtidigt resulterar i förlust av livskraft10. Utnyttjande av syntetisk dödlighet vid cancerbehandling kan bidra till att identifiera och mekaniskt karakterisera robusta syntetiska dödliga genetiska interaktioner11. Vi har antagit ett kombinatoriskt tillvägagångssätt för shRNA-screening med hög genomströmning med syntetisk dödlighet för att identifiera de epigenetiska faktorer som är ansvariga för förvärvad cytarabinresistens vid AML.
Akuta leukemier som drivs av kromosomal translokation av den blandade leukemigenen (MLL eller KMT2A) är kända för att vara associerade med dålig överlevnad hos patienter. De resulterande chimärta produkterna av MLL-genomläggningar, dvs MLL-fusionsproteiner (MLL-FP), kan omvandla hematopoetiska stam- / stamceller (HSPC) till leukemiska blaster med inblandning av flera epigenetiska faktorer. Dessa epigenetiska regulatorer utgör ett komplicerat nätverk som dikterar upprätthållandet av leukemiprogrammet och kan därför bilda potentiella terapeutiska mål. I detta sammanhang använde vi MV4-11-cellinjen (som hyser MLL-fusionsgenen MLL-AF4 med FLT3-ITD-mutationen; benämnd MV4-11 P) för att utveckla den förvärvade cytarabinresistenta cellinjen, benämnd MV4-11 AraC R. Cellinjen utsattes för ökande doser av cytarabin med intermittent återhämtning från läkemedelsbehandlingen, känd som en läkemedelssemester. Den halvmaximatiska hämmande koncentrationen (IC50) bedömdes genom cytotoxicitetsanalys in vitro.
Vi använde det poolade epigenetiska shRNA-biblioteket (se Materialtabell) som drivs av hEF1a-promotorn med en pZIP-lentiviral ryggrad. Detta bibliotek består av shRNA som riktar sig till 407 epigenetiska faktorer. Varje faktor har 5-24 shRNA, med totalt 5 485 shRNA, inklusive fem icke-riktade kontrolls-shRNA. Den modifierade “UltrmiR” miR-30-ställningen har optimerats för effektiv primär shRNA-biogenes och uttryck12,13.
Konturerna av detta experiment illustreras i figur 1A. Det nuvarande protokollet fokuserar på RNAi-screening med användning av det epigenetiska faktor shRNA-biblioteket i MV4-11 AraC R-cellinjen (figur 1B), en suspensionscellinje. Detta protokoll kan användas för att screena alla riktade bibliotek i valfri läkemedelsresistent cellinje. Det bör noteras att transduktionsprotokollet kommer att vara annorlunda för vidhäftande celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-interferens (RNAi) används i stor utsträckning för funktionella genomikstudier, som inkluderar siRNA- och shRNA-screening. Fördelen med shRNA är att de kan införlivas i plasmidvektorer och integreras i genomiskt DNA, vilket resulterar i stabilt uttryck och därmed mer långvarig knockdown av mål-mRNA. En poolad shRNA-biblioteksscreening är robust och kostnadseffektiv jämfört med de konventionella arrayed screens (siRNA). Att identifiera väsentligheten hos en specifik klass av proteiner i en genom-bred skä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansieras delvis av ett bidrag från Institutionen för bioteknik BT/PR8742/AGR/36/773/2013 till SRV; och Institutionen för bioteknik Indien BT / COE / 34 / SP13432/2015 och Institutionen för vetenskap och teknik, Indien: EMR / 2017/003880 till P.B. RVS och P.B. stöds av Wellcome DBT India Alliance IA / S / 17/1 / 503118 respektive IA / S / 15/1 / 501842. S.D. stöds av CSIR-UGC-stipendiet, och S.I. stöds av ett ICMR senior research fellowship. Vi tackar Abhirup Bagchi, Sandya Rani och CSCR Flow Cytometry Core Facility-personalen för deras hjälp. Vi tackar också MedGenome Inc. för att ha hjälpt till med sekvensering och dataanalys med hög genomströmning.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
